諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物對(duì)烏鱧免疫活性的影響【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物對(duì)烏鱧免疫活性的影響</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí)

2、 水產(chǎn)養(yǎng)殖 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄<

3、/b></p><p><b>　　1引言1</b></p><p><b>　　2 材料與方法1</b></p><p><b>　　2.1材料1</b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種1</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)用

4、魚1</p><p>　　2.1.3實(shí)驗(yàn)用水2</p><p>　　2.1.4 藥品和試劑2</p><p>　　2.2 試驗(yàn)方法2</p><p>　　2.2.1 溶壁微球菌懸液的制備2</p><p>　　2.2.2肽聚糖注射液的制備2</p><p>　　2.2.3注射實(shí)驗(yàn)2

5、</p><p>　　2.2.4 血清、血細(xì)胞樣本的采集2</p><p>　　2.2.5血細(xì)胞脆性（EOB）的測(cè)定2</p><p>　　2.2.6血細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBS）2</p><p>　　2.2.7溶菌酶活力的測(cè)定2</p><p>　　2.2.8血液生化指標(biāo)的測(cè)定2</p><p&

6、gt;<b>　　2.3數(shù)據(jù)分析3</b></p><p><b>　　3 結(jié)果3</b></p><p>　　3.1諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血液生理指標(biāo)的影響3</p><p>　　3.1.1諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞數(shù)量的影響3</p><p>　　3.1.2諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖

7、對(duì)烏鱧血細(xì)胞脆性的影響3</p><p>　　3.1.3 諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧溶菌酶活力的影響4</p><p>　　3.2諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血液生化指標(biāo)的影響4</p><p>　　3.2.1 血清總蛋白TP4</p><p>　　3.2.2 血清白蛋白ALB5</p><p>　　3.2.3

8、 堿性磷酸酶ALP5</p><p>　　3.2.4 尿素氮BUN6</p><p>　　3.2.5 乳酸脫氫酶LDH6</p><p>　　3.2.6 乳酸脫氫酶同工酶LDH17</p><p><b>　　4 討論7</b></p><p>　　4.1 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物血細(xì)胞數(shù)量和

9、血細(xì)胞脆性的影響7</p><p>　　4.2 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶活力的影響8</p><p>　　4.3免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物血清總蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）的影響8</p><p>　　4.4 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物堿性磷酸酶（ALP）的影響8</p><p>　　4.5 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物尿素氮（BUN）的影響9<

10、/p><p>　　4.6免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物乳酸脫氫酶（LDH）和乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）的影響9</p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)10</b></p><p>　　摘要：采用濃度為16.7mg/mL的鰤?mèng)~諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物對(duì)烏鱧進(jìn)行腹腔注射，于實(shí)驗(yàn)24h、48

11、h、72h、96h、120h、144h、168h時(shí)取其血液測(cè)定血細(xì)胞數(shù)目、血細(xì)胞脆性（EOB）、溶菌酶活力（LSZ）、血清總蛋白（TP）含量、血清白蛋白(ALB)含量、堿性磷酸酶（ALP）活性、尿素氮（BUN）含量、乳酸脫氫酶（LDH）活性以及乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）等與烏鱧免疫力相關(guān)的血液生理指標(biāo)和生化指標(biāo)，結(jié)果表明：鰤?mèng)~諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖使烏鱧血細(xì)胞數(shù)目和血細(xì)胞脆性均有增加，但影響不顯著（P>0.05）；溶菌酶活力、血清

12、總蛋白和血清白蛋白在48h時(shí)顯著上升（P<0.05）；堿性磷酸酶ALP活性與對(duì)照組相比，均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且差異性顯著（P<0.05）；尿素氮水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)96 h后保持相對(duì)穩(wěn)定；乳酸脫氫酶活性和乳酸脫氫酶同工酶均在72h時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），說(shuō)明鰤?mèng)~諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖能夠增強(qiáng)烏鱧的免疫活性。</p><p>　　關(guān)鍵詞：諾卡氏菌；肽聚糖；

13、烏鱧；血液生理指標(biāo)；血液生化指標(biāo)</p><p>　　Abstract:With 16.7g/mL of Yellowtail Nocardia cell wall peptidoglycan intraperitoneal injection for argus, at 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h after the experimental collect blo

14、od to determine the Red blood cell count, blood cell fragility(EOB), Lysozyme activity(LSZ), serum total protein (TP), serum albumin(ALB), alkaline phosphatase(ALP), blood urea nitrogen (BUN), lactate dehydrogenase (LDH)

15、, lactate dehydrogenase isoenzyme (LDH1) and other physiological and biochemical indexes of blood r</p><p><b>　　朗讀</b></p><p>　　顯示對(duì)應(yīng)的拉丁字符的拼音</p><p><b>　　字典</b&g

16、t;</p><p>　　Key words: Nocardia; peptidoglycan; Ophicephalus argus; blood physiological parameters; blood biochemical parameters</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　諾卡氏菌（Nocard

17、ia）為革蘭氏陽(yáng)性菌，好氧，分類上屬細(xì)菌域，厚壁菌門，放線菌綱，放線菌目，諾卡氏菌科。菌體呈長(zhǎng)或短桿狀, 或細(xì)長(zhǎng)分枝狀，常斷裂成桿狀至球狀體，基絲發(fā)達(dá)，呈分枝狀，氣絲較少。魚類諾卡氏菌病于1963年在全球首次報(bào)告，確認(rèn)于阿根廷熱帶養(yǎng)殖的虹彩脂魚（Hyphessobrycon innesi）[1]。隨后此病又陸續(xù)發(fā)生在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、黃尾鰤（Seriola lalandi）、烏鱧、大西洋牡蠣（Crassos

18、trea gigas）、大口鱸（Micropterus salmoides）和海鱸（Lateolabrax japonicus）等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中，曾影響日本、美國(guó)、澳大利亞、加拿大等地的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，造成很大經(jīng)濟(jì)損失[2]。該病曾是日本水產(chǎn)養(yǎng)殖中最主要的水產(chǎn)動(dòng)物疾病之一，也是大西洋牡蠣養(yǎng)殖的主要疾病。而該病近年來(lái)對(duì)我國(guó)大陸和臺(tái)灣水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也產(chǎn)生了較大影響，先后在烏鱧、大口鱸、海鱸、大黃魚等養(yǎng)殖魚類中發(fā)生此病[3]。</p>

19、<p>　　肽聚糖( peptidoglycan) 又稱粘肽、胞壁質(zhì)或粘質(zhì)復(fù)合物，由雙糖單位，四肽尾還有肽橋聚合而成，是N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAMA）交替連接的雜多糖與不同組成的肽交叉連接形成的多層網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)。其是一種多糖與氨基酸相連的多糖復(fù)合物，由于此復(fù)合物中氨基酸鏈不像蛋白質(zhì)中的那樣長(zhǎng)，故稱肽聚糖。肽聚糖是許多細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，不同的肽聚糖中出現(xiàn)的氨基酸數(shù)是有限的，亞肽單位及間肽橋上氨基酸的

20、組成及排列上的不同，決定了肽聚糖種類的多樣性[4]。近年來(lái)的大量的研究結(jié)果表明，肽聚糖具有包括佐劑活性在內(nèi)的多種生物活性。肽聚糖能對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，是一種免疫系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)劑。肽聚糖能夠刺激B、T 淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫，激活單核細(xì)胞及多核白細(xì)胞的吞噬活性，活化補(bǔ)體[5]，其分子中的多糖成分還具有抗腫瘤，抗感染能力[6]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中投喂肽聚糖后發(fā)現(xiàn)，其能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物如五條鰤[7]、斑

21、節(jié)對(duì)蝦[8]、日本對(duì)蝦[9]等抗病力和成活率。因此，使用肽聚糖有利于解決水產(chǎn)養(yǎng)殖中大量使用抗生素藥物防治病害所表現(xiàn)出的生物抗藥性問(wèn)題及食品的藥</p><p>　　烏鱧（Ophicephalus argus），亦稱黑魚，屬鱸形目，攀鱸亞目，鱧科，鱧屬，體呈烏黑色，細(xì)長(zhǎng)，前部圓筒狀，后部側(cè)扁，由背至腹顏色逐漸變淺，圓鱗。烏鱧分布極為廣泛，除西部高原地區(qū)外，從黑龍江至海南的河川、湖泊、水庫(kù)、池塘等各種類型的水體中均有

22、發(fā)現(xiàn)，國(guó)外產(chǎn)于朝鮮西、南部。烏鱧肉質(zhì)鮮美，富含蛋白質(zhì)、脂肪、18種氨基酸等，還含有人體必需的鈣、磷、鐵及多種維生素，營(yíng)養(yǎng)豐富、肉味甘性溫且骨刺少，有補(bǔ)脾、利水的藥用功能，深受群眾的歡迎。烏鱧是一種適應(yīng)性強(qiáng)、對(duì)不良水溫、水質(zhì)及缺氧條件有較強(qiáng)耐受力的魚類，在江河湖塘等自然環(huán)境中很少發(fā)病。但隨著烏鱧人工高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，由于養(yǎng)殖密度過(guò)高，養(yǎng)殖區(qū)域水質(zhì)惡化嚴(yán)重，以及烏鱧經(jīng)過(guò)多代人工繁育造成種質(zhì)退化，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降等原因，烏鱧的病害時(shí)有發(fā)生，

23、且呈現(xiàn)出種類多、流行范圍廣、防治效果不明顯等特點(diǎn)，給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失，也對(duì)烏鱧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展起著嚴(yán)重的阻礙作用。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以烏鱧為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)烏鱧人工注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物，研究其對(duì)烏鱧免疫活性指標(biāo)的影響，為烏鱧諾卡氏菌病的防治提供理論參考。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><

24、p><b>　　2.1材料</b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種 </p><p>　　鰤?mèng)~諾卡氏菌（Nacardia seriolea）、溶壁微球菌（Microcrococcus lysodeikticus）。</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)用魚</p><p>　　烏鱧（O.argus )購(gòu)自

25、寧波水產(chǎn)市場(chǎng)，體重400~500g，體長(zhǎng)約30cm，共40尾。經(jīng)高錳酸鉀全身消毒后，分成2組，分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。暫養(yǎng)于室內(nèi)大塑料桶中并用遮陽(yáng)布遮蓋，以保持適宜的環(huán)境暗度。根據(jù)水質(zhì)情況每天適時(shí)換水1~2次，每次換水1/3。定時(shí)定量投喂小魚，及時(shí)吸出殘餌和糞便，保持水質(zhì)的清潔。</p><p>　　2.1.3實(shí)驗(yàn)用水 </p><p>　　實(shí)驗(yàn)用水為充分曝氣處理的自來(lái)水，試驗(yàn)期間使用充氧泵

26、持續(xù)充氧。</p><p>　　2.1.4 藥品和試劑 </p><p>　　血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）、乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）等試劑盒購(gòu)自美康生物科技有限公司；0.067mol/L磷酸緩沖液（KH2PO4 73mL，0.067mol/L K2HPO4 27mL，NaCl 0.5g，pH 6.4）；0.75

27、%的生理鹽水；鰤?mèng)~諾卡氏菌肽聚糖（本研究室自制）。</p><p><b>　　2.2 試驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 溶壁微球菌懸液的制備 </p><p>　　將溶壁微球菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用0.067mol/L PBS（pH 6.4）將溶壁微球菌從營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上洗下，配成0.2mg

28、/mL的菌懸液（在570nm處的吸光值為A=0.400），備用。</p><p>　　2.2.2肽聚糖注射液的制備 </p><p>　　取鰤?mèng)~諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物0.25g溶于15ml的0.75%生理鹽水中，制成濃度為0.0167g/mL的肽聚糖注射液。</p><p>　　2.2.3注射實(shí)驗(yàn) </p><p>　　采用腹部注射

29、的方法將已配好的肽聚糖溶液注射到實(shí)驗(yàn)組魚體內(nèi)，每尾注射0.5ml，對(duì)照組注射同量無(wú)菌生理鹽水。注射后分別在24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h時(shí)每組取魚3尾，抽取其血液樣本，用以各項(xiàng)血液指標(biāo)的檢測(cè)。</p><p>　　2.2.4 血清、血細(xì)胞樣本的采集 </p><p>　　將烏鱧側(cè)放平躺于解剖盤中，尾部穿刺靜脈采血后，一部分放置于離心管中4℃靜置過(guò)夜，經(jīng)30

30、00r/min離心后吸出血清，用于溶菌酶活力和各項(xiàng)生化指標(biāo)的測(cè)定；另一部分用無(wú)菌肝素鈉抗凝，用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血細(xì)胞脆性的測(cè)定，當(dāng)天完成。</p><p>　　2.2.5血細(xì)胞脆性（EOB）的測(cè)定</p><p>　　配置系列濃度為0.17%~0.45%（梯度為0.02%）的NaCl溶液放入若干支試管中并編號(hào)，取血后立即向各試管中滴入一滴血并揉搓混勻，室溫下放置2小時(shí)后觀察結(jié)果，以完全溶血

31、的NaCl濃度作為紅細(xì)胞最大抵抗值，即紅細(xì)胞的最小脆性。</p><p>　　2.2.6血細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBS）</p><p>　　按Neubuer氏改良方法進(jìn)行。用5mL移液槍準(zhǔn)確吸取3.98mL紅細(xì)胞稀釋液于干凈試管內(nèi)，然后用毛細(xì)吸管吸20μl血放入試管底部，輕輕搖振試管1~2min，以混勻稀釋的血液，然后用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。</p><p>　　2.2.7溶菌

32、酶活力的測(cè)定</p><p>　　根據(jù)簡(jiǎn)紀(jì)常[10]的方法進(jìn)行。吸取40uL血清加入到3mL溶壁微球菌菌懸液中，均勻混合后立刻在540nm下測(cè)定A0值；然后在28℃水浴中溫浴30min，取出后置于4℃冰浴中以終止反應(yīng)，再測(cè)定A值；最后按公式計(jì)算溶菌酶活力：U=(A0-A)/A。</p><p>　　2.2.8血液生化指標(biāo)的測(cè)定 </p><p>　　血清總蛋白（

33、TP）、血清白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）、乳酸脫氫酶同工酶1（LDH1）等的測(cè)定均在日立7020全自動(dòng)生化儀上完成，具體方法根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。</p><p><b>　　2.3數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　所得結(jié)果均以3個(gè)平行組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SE)表示；所有數(shù)據(jù)分析均采用

34、SPSS 13.0 (Statiscal Package for the Social Science) 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-factor analysis of variance)和均值多重比較分析(LSD法)。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血液生理指標(biāo)的影響</p>

35、<p>　　3.1.1諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞數(shù)量的影響</p><p>　　烏鱧注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后血細(xì)胞數(shù)目的變化情況見(jiàn)圖1。由圖1可知，烏鱧在注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后，實(shí)驗(yàn)144h內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組血細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比都有增加，但均不存在顯著性差異（P>0.05）。</p><p>　　圖1肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞數(shù)量的影響</p><p&g

36、t;　　Fig.1 Effects of peptidoglycan on the Red blood cell count of Ophicephalus argus</p><p>　　3.1.2諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞脆性的影響</p><p>　　烏鱧注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后血細(xì)胞脆性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)48h后實(shí)驗(yàn)組烏鱧血細(xì)胞脆性比對(duì)照組均略有增大，但

37、差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖2 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞脆性的影響</p><p>　　Fig.2 Effects of peptidoglycan on the blood cell fragility of Ophicephalus argus</p><p>　　3.1.3 諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧溶菌酶活力的影響

38、</p><p>　　注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后，烏鱧血液溶菌酶活力的變化情況見(jiàn)圖3。由圖3可知，實(shí)驗(yàn)48h時(shí)實(shí)驗(yàn)組溶菌酶活力與對(duì)照組相比有顯著增強(qiáng)（P<0.05）；其它實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖3 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧溶菌酶活力的影響</p><p>　　Fig.3 Effects of peptidog

39、lycan on the Lysozyme activity of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血液生化指標(biāo)的影響</p><p>　　3.2.1 血清總蛋白TP</p><p>　　圖4為烏鱧注射諾卡氏

40、菌細(xì)胞壁肽聚糖后血清總蛋白TP的變化情況。由圖4可知，在實(shí)驗(yàn)48h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組烏鱧血清總蛋白含量迅速增高并顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但其后逐漸降低，與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖4 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血清總蛋白TP的影響</p><p>　　Fig.4 Effects of peptidoglycan on the serum t

41、otal protein of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.2 血清白蛋白ALB</p><p>　　注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后，烏鱧血液血清白蛋白ALB的變化情況見(jiàn)圖5。由圖5可知，烏鱧在注射肽聚糖后，其血清白蛋白含量有增高趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)48h時(shí)顯著大于

42、對(duì)照組（P<0.05），但其它實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)差異性不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖5 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血清白蛋白ALB的影響</p><p>　　Fig.5 Effects of peptidoglycan on the serum albumin of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與

43、對(duì)照組存在顯著性差異（P>0.05）</p><p>　　3.2.3 堿性磷酸酶ALP</p><p>　　注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧堿性磷酸酶ALP活性的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶ALP活性與對(duì)照組相比，均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)24h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶活性最大，實(shí)驗(yàn)24h、48h、96h、144h、168h時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P<0.05

44、）。</p><p>　　圖6 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧堿性磷酸酶ALP活性的影響</p><p>　　Fig.6 Effects of peptidoglycan on the alkaline phosphatase of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p>

45、;<p>　　3.2.4 尿素氮BUN</p><p>　　圖7為烏鱧注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后尿素氮BUN含量的變化情況。由圖7可知，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組烏鱧尿素氮水平逐漸低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)96h后保持相對(duì)穩(wěn)定，且均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。</p><p>　　圖7 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧尿素氮BUN的影響</p><p>

46、　　Fig.7 Effects of peptidoglycan on the blood urea nitrogen of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.5 乳酸脫氫酶LDH</p><p>　　注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧乳酸脫氫酶LDH活性的影

47、響見(jiàn)圖8。由圖8可知，在實(shí)驗(yàn)72h內(nèi)烏鱧血液乳酸脫氫酶活性逐漸增強(qiáng)，72h時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；其后逐漸降低，并一直處于對(duì)照組水平附近，差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖8 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧乳酸脫氫酶LDH的影響</p><p>　　Fig.8 Effects of peptidoglycan on the lactat

48、e dehydrogenase of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.6 乳酸脫氫酶同工酶LDH1</p><p>　　圖9為注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后對(duì)烏鱧乳酸脫氫酶同工酶1LDH1活性的影響。由圖9可知，在72h時(shí)實(shí)驗(yàn)組烏鱧血液乳酸脫氫酶同工酶活性最強(qiáng)

49、，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；其它實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖9 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧乳酸脫氫酶同工酶LDH1的影響</p><p>　　Fig.9 Effects of peptidoglycan on the lactate dehydrogenase isoenzyme of Ophicephalus arg

50、us</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　4.1 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物血細(xì)胞數(shù)量和血細(xì)胞脆性的影響</p><p>　　血細(xì)胞是魚類對(duì)自身生理狀態(tài)變化和對(duì)外界環(huán)境因子刺激非常敏感的細(xì)胞,是魚類機(jī)體免疫的重要成分，其組

51、成包括紅細(xì)胞和白細(xì)胞,其中白細(xì)胞直接參與了免疫應(yīng)答及其他與免疫應(yīng)答直接相關(guān)的過(guò)程，同時(shí)肩負(fù)著魚類機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫的主要機(jī)能[11]。因此, 通過(guò)測(cè)定魚類血液中血細(xì)胞的數(shù)量, 可以間接反映出被測(cè)魚類機(jī)體的免疫狀態(tài)。免疫多糖是指具有促進(jìn)或誘發(fā)宿主防御反應(yīng)，增強(qiáng)生物機(jī)體抗病能力的一類物質(zhì)，某些特定的復(fù)合糖化物(Complex carbohydlrates)可誘導(dǎo)生物體，提高自身免疫力，具有免疫激活特性[12]，目前主要有肽聚糖、脂

52、多糖、葡聚糖及藻類多糖等。</p><p>　　汪小鋒等人的研究表明,經(jīng)β2葡聚糖、脂多糖刺激后,中國(guó)對(duì)蝦總血細(xì)胞的數(shù)量分別增多了83.4%、52.0% [13]，而火村英等人發(fā)現(xiàn)采用注射和投餌酵母多糖的方式可使魚類血液中NBT陽(yáng)性細(xì)胞增加[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)烏鱧血細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后，烏鱧的血細(xì)胞數(shù)量有所增加，增強(qiáng)了魚體的免疫力，這與以上學(xué)者的研究結(jié)果相似，但持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，且差

53、異性不顯著。筆者認(rèn)為這可能與采用注射方式，肽聚糖注射量以及所選試驗(yàn)用魚有關(guān)。</p><p>　　魚類血細(xì)胞脆性的變化是反映魚類健康狀況的重要指標(biāo)，新生紅細(xì)胞脆性較小, 衰老紅細(xì)胞脆性較大。血液中新生紅細(xì)胞比率的減少，血細(xì)胞趨于老化，造血機(jī)能受到抑制以及腎、脾等造血組織遭到破壞均會(huì)導(dǎo)致魚類血細(xì)胞脆性的上升[15]。本研究的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組烏鱧血細(xì)胞的脆性未出現(xiàn)顯著變化（P>0.05），表明諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚

54、糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞脆性的影響不顯著。</p><p>　　4.2 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶活力的影響</p><p>　　溶菌酶是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ),是一種堿性蛋白,可通過(guò)水解革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁中的乙酰氨基多糖,破壞和消除侵入體內(nèi)的異物,從而擔(dān)負(fù)起機(jī)體防御的功能[16]。魚類的特異性免疫系統(tǒng)并不完善,非特異性免疫在魚類免疫防御中具有重要作用,因此,溶菌酶是魚類極為重要的非特異性免疫指標(biāo)之

55、一。郭玉娟等人的研究結(jié)果表明A_(3α)肽聚糖顯著提高了受免彭澤鯽血清及體表溶菌活力[18]；張春曉等人[19]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加肽聚糖后，實(shí)驗(yàn)組大黃魚血液白細(xì)胞吞噬活力和血清溶菌酶活力顯著高于對(duì)照組；張璐等人的研究結(jié)果也證明了鱸魚血清溶菌酶活力會(huì)隨著飼料中肽聚糖添加量的升高而升高[20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)烏鱧注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后的溶菌酶活力測(cè)定結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的溶菌酶活力在48h明顯高于對(duì)照組，并存在顯著性差異（P<0.05），

56、表明諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖能顯著提高烏鱧血清溶菌酶活性，增強(qiáng)烏鱧的非特異性免疫力，但效果具有明顯時(shí)效性，這與宋曉玲[17]等關(guān)于雙歧桿菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)牙鲆免疫活性影響的研究結(jié)果及許國(guó)煥[21，22，23，24] 等關(guān)于酵母多糖、β2葡聚糖、黃芪多糖的研究結(jié)果十分相似。</p><p>　　4.3免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物血清總蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）的影響</p><p>　　血清蛋白含量

57、是衡量免疫力的一個(gè)重要指標(biāo)。研究表明，血清總蛋白水平與血清溶菌酶水平密切相關(guān)，溶菌酶活性升高時(shí)，其血清蛋白含量也隨之升高，機(jī)體對(duì)病原菌的抵抗力顯著增強(qiáng)[25,26,27]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，烏鱧在注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后血清總蛋白（TP）的含量迅速增加，并均在第48h達(dá)到最大值，存在顯著性差異（P<0.05），但具有明顯時(shí)效性，72h后便降至原來(lái)水平。這與趙紅霞等人的研究結(jié)果相似[28]，其研究表明在飼料中長(zhǎng)期添加β-1,3

58、-葡聚糖使凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)血清總蛋白含量顯著升高。另外，王紅權(quán)等人也報(bào)道了草魚在口服0.5%的免疫增強(qiáng)劑殼聚糖40d后其體內(nèi)血清總蛋白含量得到顯著增加（P<0.05）。</p><p>　　魚體血清白蛋白在各種生理活動(dòng)中有重要作用，對(duì)維持魚體足夠血量及膠體滲透壓有重要意義，是魚體重要的免疫蛋白，與魚體的抗病及環(huán)境適應(yīng)能力有密切的關(guān)系，可以用來(lái)診斷魚類健康、營(yíng)養(yǎng)和疾病等狀況，血清白蛋白含量的高低直接體現(xiàn)了魚類免

59、疫力的高低[29]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖同樣對(duì)烏鱧血清白蛋白含量的增加有促進(jìn)效果，且與血清總蛋白的變化趨勢(shì)大致相同。肖明松等人對(duì)中華鱉的研究所描述的結(jié)果大致相同，即果寡糖和糖萜素可以顯著提高血清白蛋白的含量（P<0.05）[30]。</p><p>　　4.4 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物堿性磷酸酶（ALP）的影響</p><p>　　堿性磷酸酶為磷酸單酯酶, 廣泛存在于各種

60、動(dòng)物體內(nèi), 其作為一種重要的水解酶，不僅能催化磷酸單酯水解,還直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移,是動(dòng)物體內(nèi)重要的解毒體系,并且在動(dòng)物機(jī)體的骨化過(guò)程中及在磷化物和其他一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要作用;同時(shí)堿性磷酸酶作為動(dòng)物溶酶體酶的重要組成部分,在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[31]。堿性磷酸酶活性的提高，可以加速魚類相應(yīng)組織的物質(zhì)代謝，為ADP磷酸化形成ATP提供所需的無(wú)機(jī)磷，積累更多的能量，從而促進(jìn)生長(zhǎng)，也間接增強(qiáng)了其非特異性免疫能力[3

61、2]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖能夠顯著提高烏鱧堿性磷酸酶活性（P<0.05）。這與宋曉玲等人[17]在研究雙歧桿菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)日本對(duì)蝦免疫活性影響時(shí)得出的結(jié)論相似：經(jīng)研究表明，肽聚糖可影響日本對(duì)蝦血清的ALP活性和ACP活性,且兩種作用趨勢(shì)相近，96h內(nèi)呈逐漸平緩上升的趨勢(shì)，提高了日本對(duì)蝦的非特異性免疫水平。另外，陳國(guó)福等[33]和王秀華等[34]分別給凡納濱對(duì)蝦和南美白對(duì)蝦投喂肽聚糖后堿性磷酸酶活性均得到了提

62、高。</p><p>　　4.5 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物尿素氮（BUN）的影響</p><p>　　血漿尿素氮可以較準(zhǔn)確反映動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況和日糧氨基酸的平衡情況。蛋白質(zhì)代謝良好時(shí)，血漿尿素濃度降低[35]。有報(bào)道認(rèn)為血清尿素氮水平是衡量動(dòng)物氨基酸需要的一個(gè)很靈敏的參考指標(biāo)，它是反映機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀況及蛋白質(zhì)代謝水平的指標(biāo)，直接反映動(dòng)物機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝水平[36]。因此，血清中尿素氮含

63、量越低，說(shuō)明機(jī)體蛋白質(zhì)代謝越好。本研究結(jié)果顯示，烏鱧經(jīng)注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖，其體內(nèi)尿素氮含量得到顯著性降低（P<0.05），說(shuō)明烏鱧的代謝旺盛，暗示了其非特異性免疫水平的提高。類似結(jié)果也出現(xiàn)在肖明松等[30]用果寡糖與糖萜素投喂中華鱉的試驗(yàn)中，該研究表明，果寡糖和糖萜素作為免疫增強(qiáng)劑可以顯著降低中華鱉血清中尿素氮的含量。</p><p>　　4.6免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物乳酸脫氫酶（LDH）和乳酸脫氫酶同工酶

64、（LDH1）的影響</p><p>　　乳酸脫氫酶及其同工酶是與能量代謝過(guò)程密切相關(guān)的酶。在無(wú)氧條件下，LDH催化丙酮酸還原成乳酸,從而完成葡萄糖的無(wú)氧酵解過(guò)程；同時(shí)釋放少量ATP分子，為缺氧狀態(tài)下的機(jī)體生命活力提供一定的能量。本研究的結(jié)果顯示，乳酸脫氫酶和乳酸脫氫酶同工酶1的活性在注射試驗(yàn)后未出現(xiàn)明顯變化，但72h后均出現(xiàn)顯著的升高（P<0.05），但隨后又降至正常水平。有關(guān)免疫增強(qiáng)劑對(duì)魚類血清中乳酸脫氫

65、酶及其同工酶的研究筆者尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。筆者認(rèn)為，諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖本身作為一種抗原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并激活機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用，顯著提高血液內(nèi)各種酶的活性，增強(qiáng)代謝并消除抗原，進(jìn)而增強(qiáng)了烏鱧的免疫水平。</p><p>　　綜上所述，諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖能夠顯著提高烏鱧血清溶菌酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶及其同工酶1的活性，增加血清總蛋白和白蛋白的含量，增強(qiáng)烏鱧的非特異性和特異性免疫應(yīng)答水平，因此，肽聚糖作

66、為一種新型的免疫增強(qiáng)劑，用來(lái)提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫活性和抗細(xì)菌、病毒病感染，具有十分良好的應(yīng)用前景。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 杜佳根.魚類諾卡氏菌病危害狀況與研究進(jìn)展[J].遼寧省大連市大連水產(chǎn)學(xué)院,2007(5):27-31.</p><p>　　[2] 袁思平,王國(guó)良,金珊.養(yǎng)殖魚類致病諾

67、卡氏菌研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2006,33(2):137-141.</p><p>　　[3] 王國(guó)良,袁思平,金珊.網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚諾卡氏菌病的初步研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2006,30(1):103-107.</p><p>　　[4] 和致中.細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的分類[J].微生物學(xué)通報(bào),1992.19(3):174-179.</p><p>　　[5]

68、 聞?dòng)衩?陸德源.現(xiàn)代微生物學(xué)[M].第2版.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1992:1-2.</p><p>　　[6] Takashi S. ,Fukami S. ,Shigeo Namioka. Ehanced resistance of mice to Escheriehia coli infection induced by administration of Peptidoglycan derived

69、 from Bidoaoteriun thermo phylum[J].Vet. Medical Sci.,1994,56:433.</p><p>　　[7] Itami T. , Kondo M. ,Uozu M.et al. Enhancement of disease resistance against Enterococcus seriolicida infection in yellowtail

70、Seriola quinqueradiata Temminck and Schlegel by oral administration of Peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum[J]. J . Fish Dis .1996.19:185-187.</p><p>　　[8] Sitdhi B ,Mali B. Effects of pe

71、ptidoglycan(PG) on growth , survival , Immune response and tolerance to stress in black tiger shrimp , Penaeus monodon[J]. Diseases in Asian Aquaculture II.1995,469-477.</p><p>　　[9] Itami T , Masaya A. Enh

72、ancement of disease resistance of kuruma shrimp ,penaeus japonicus after oral administration of peptidoglican derived from Bif idobacterium thermophilum[J]. Aquacuture,1998, 164:277-288.</p><p>　　[10] 簡(jiǎn)紀(jì)常,吳灶

73、和.中草藥對(duì)建鯉非特異性免疫功能的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,17(2):114-119.</p><p>　　[11] 周永燦,邢玉娜,馮全英.魚類血細(xì)胞研究進(jìn)展[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003,21(2):171-176.</p><p>　　[12] 王秀華,黃倢,宋曉玲.免疫增強(qiáng)劑—肽聚糖在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].海洋水產(chǎn)研究,2003,24(1):69-74

74、.</p><p>　　[13] 汪小鋒,樊廷俊,叢日山,等.幾種免疫促進(jìn)劑對(duì)中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及酚氧化酶產(chǎn)量和活性的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2005,29(1):66-73.</p><p>　　[14] 火村英,周國(guó)勤,杜宣.酵母多糖的提取及其對(duì)魚類非特異性免疫功能的影響[J].生物技術(shù),2004,14(3):45-47.</p><p>　　[15]

75、 金珊,王國(guó)良,趙青松,等.鱸細(xì)菌性類結(jié)節(jié)病的病原及血液病理研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2004,28(6):703-708.</p><p>　　[16] 劉云,孔偉麗,姜國(guó)良,等.2種免疫多糖對(duì)刺參組織主要免疫酶活性的影響[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2008,15(5):787-792.</p><p>　　[17] 宋曉玲,楊緒彤,偲瀚文,等.雙歧桿菌細(xì)胞壁肽聚糖的分離及其對(duì)二種海產(chǎn)動(dòng)物免疫活性

76、的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2005,29(3):351-355.</p><p>　　[18] 郭玉娟,陳學(xué)年.A_(3α)肽聚糖對(duì)受免彭澤鯽免疫應(yīng)答影響的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,28(5):562-565.</p><p>　　[19] 張春曉,麥康森,艾慶輝,等.飼料中添加肽聚糖對(duì)大黃魚生長(zhǎng)和非特異性免疫力的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2008,32(3):411-416.&l

77、t;/p><p>　　[20] 張璐,艾慶輝,麥康森,等.肽聚糖對(duì)鱸魚生長(zhǎng)和非特異性免疫力的影響[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,38(4):551-556.</p><p>　　[21] 許國(guó)煥,吳月嫦,陶家發(fā).兩種多聚糖對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)影響及免疫促進(jìn)作用的初步研究[J].水利漁業(yè),2002,22(4):49-51.</p><p>　　[22] 張偉妮,

78、林旋,王壽昆,等.黃芪多糖對(duì)羅非魚非特異性免疫和胃腸內(nèi)分泌功能的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22(2):401-409.</p><p>　　[23] 徐海華,李兆文,汪成竹,等.免疫多糖對(duì)受免黃鱔免疫保護(hù)力的增強(qiáng)作用[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,26(1):80-84.</p><p>　　[24] 劉勇,楊季芳,陳昌福.免疫增強(qiáng)劑對(duì)河鯽魚白細(xì)胞吞噬和溶菌酶活

79、性的影響[J].河北漁業(yè),2007,35(1):111-113.</p><p>　　[25] Hutchinson T H，Manning M J. Seasonal trends in serum lysonzyme activity and total protein concentration in dab(Limanda limanda L.)sampled from Lyme Bay，UK[J].Fi

80、sh and Shellfish Immunology,1996,6:473-482．</p><p>　　[26] Rungruangsak-Torrissen K, Wergeland H I, Glette J. Disease resistance and immune parameters in Atlantic salmon(Salmo salar L.) with genetically diffe

81、rent trypsin isozymes[J].Fish and Shellfish Immunology,1999,9:557-568．</p><p>　　[27] Misra C K, Das B K, Mukherjee S C．Effect of long term administration of dietary β-glucan on immunity, growth and survival

82、of Labeo rohita fingerlings[J]. Aquaculture,2006,255:82-94．</p><p>　　[28] 趙紅霞,曹俊明,王安利,等.飼料中添加β-1,3-葡聚糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、體成分和生化指標(biāo)的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22(5):1464-1470.</p><p>　　[29] 劉穎,喬偉亮,魏東,等.黑鯛血清生化指標(biāo)研究[

83、J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2010,(16):307-308.</p><p>　　[30] 肖明松,洪玉中,葛威.果寡糖與糖萜素對(duì)中華鱉血清生化指標(biāo)的影響[J].糧食與飼料工業(yè),2004,(6):35-37.</p><p>　　[31] 孫靜秋,許燕,張慧綺,等.凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)ACP、AKP酶的細(xì)胞化學(xué)定位[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,6(6):947-951.</p>

84、;<p>　　[32] 周進(jìn),宋曉玲,陳國(guó)福,等.A_(3α)肽聚糖不同投喂方式下牙鲆血清及組織中相關(guān)酶的變化[J].飼料工業(yè),2006,27(2):5-10.</p><p>　　[33] 陳國(guó)福,張春云,王光玉,等.A_(3α)肽聚糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼體酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力的影響[J].水產(chǎn)科學(xué),2008,27(11):584-587.</p><p>　　[34] 王

85、秀華,宋曉玲,黃倢.肽聚糖制劑對(duì)南美白對(duì)蝦體液免疫因子的影響[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2004,11(1):26-30.</p><p>　　[35] 盧宗藩.家畜實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理生化參數(shù)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1983:127-129.</p><p>　　[36] 馬玉龍,鄒曉庭,徐梓榮.桿菌肽鋅對(duì)產(chǎn)蛋雞血清生化指標(biāo)的影響[J].飼料研究,2000,(12):22-23.</p>