諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物對(duì)烏鱧免疫活性的影響【開(kāi)題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開(kāi)題報(bào)告</b></p><p><b>　　水產(chǎn)養(yǎng)殖</b></p><p>　　諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物對(duì)烏鱧免疫活性的影響</p><p>　　一、選題的背景與意義 </p>

2、;<p>　　烏鱧（Ophicephalus argus），亦稱黑魚(yú)，屬鱸形目，攀鱸亞目，鱧科，鱧屬，體呈烏黑色，細(xì)長(zhǎng)，前部圓筒狀，后部側(cè)扁，由背至腹顏色逐漸變淺，圓鱗。烏鱧分布極廣，除西部高原地區(qū)外，從黑龍江至海南的河川、湖泊、水庫(kù)、池塘等各種類型的水體皆產(chǎn)此魚(yú)，國(guó)外產(chǎn)于朝鮮西、南部。烏鱧肉富含蛋白質(zhì)、脂肪、18種氨基酸等，還含有人體必需的鈣、磷、鐵及多種維生素，營(yíng)養(yǎng)豐富、肉味甘性溫且骨刺少，有補(bǔ)脾、利水的藥用功能，深受

3、群眾的歡迎。烏鱧是一種適應(yīng)性強(qiáng)、對(duì)不良水溫、水質(zhì)及缺氧條件有較強(qiáng)耐受力的魚(yú)類，在江河湖塘等自然環(huán)境中很少發(fā)病。但隨著烏鱧人工高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，烏鱧各種疾病頻頻發(fā)生，特別是水霉病、腐皮病、腹水病、爛鰓病危害嚴(yán)重，諾卡氏菌病也在近幾年流行起來(lái)，造成了很嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。</p><p>　　諾卡氏菌（Nocardia）為革蘭氏陽(yáng)性菌，好氧，分類上屬細(xì)菌域，厚壁菌門，放線菌綱，放線菌目，諾卡氏菌科。菌體呈長(zhǎng)或短桿狀, 或

4、細(xì)長(zhǎng)分枝狀，常斷裂成桿狀至球狀體，基絲發(fā)達(dá)，呈分枝狀，氣絲較少。魚(yú)類諾卡氏菌病于1963年在全球首次報(bào)告，確認(rèn)于阿根廷熱帶養(yǎng)殖的虹彩脂魚(yú)（Hyphessobrycon innesi）（杜佳根 2007）。隨后此病又陸續(xù)發(fā)生在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、黃尾鰤（Seriola lalandi）、烏鱧、大西洋牡蠣（Crassostrea gigas）、大口鱸（Micropterus salmoides）和海鱸（Lateo

5、labrax japonicus）等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中，曾影響日本、美國(guó)、澳大利亞、加拿大等地的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，造成很大經(jīng)濟(jì)損失（袁思平 2006）。該病曾是日本水產(chǎn)養(yǎng)殖中最主要的水產(chǎn)動(dòng)物疾病之一, 也是大西洋牡蠣養(yǎng)殖的主要疾病。而該病近年來(lái)對(duì)我國(guó)臺(tái)灣水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也產(chǎn)生了較大影響，先后在烏鱧、大口鱸和海鱸等養(yǎng)殖魚(yú)類中發(fā)生此病。我國(guó)大陸是2006年首次在養(yǎng)殖大黃魚(yú)中發(fā)現(xiàn)諾卡氏菌病（王國(guó)良 2006）。</p><p>　　肽

6、聚糖( peptidoglycan) 又稱粘肽、胞壁質(zhì)或粘質(zhì)復(fù)合物，由雙糖單位，四肽尾還有肽橋聚合而成，是N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAMA）交替連接的雜多糖與不同組成的肽交叉連接形成的多層網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)。其是一種多糖與氨基酸相連的多糖復(fù)合物，由于此復(fù)合物中氨基酸鏈不像蛋白質(zhì)中的那樣長(zhǎng)，故稱肽聚糖。肽聚糖是許多細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，不同的肽聚糖中出現(xiàn)的氨基酸數(shù)是有限的，亞肽單位及間肽橋上氨基酸的組成及排列上的不同，決定

7、了肽聚糖種類的多樣性(和致中　1992)。近年來(lái)的大量的研究結(jié)果表明，肽聚糖具有包括佐劑活性在內(nèi)的多種生物活性。肽聚糖能對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，是一種免疫系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)劑。肽聚糖能夠刺激B、T 淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫，激活單核細(xì)胞及多核白細(xì)胞的吞噬活性，活化補(bǔ)體(聞?dòng)衩返取?992)，其分子中的多糖成分還具有抗腫瘤，抗感染能力（Takashi 1994）。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中投喂肽聚糖后發(fā)現(xiàn)，其能顯著提

8、高水產(chǎn)動(dòng)物如五條鰤（Ttami 1996）、斑節(jié)對(duì)蝦（Sitdhi Boonyaratpalin 1995）、日本對(duì)</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問(wèn)題：</p><p><b>　　研究基本內(nèi)容：</b></p><p>　　1. 諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖的分離提取。</p><p>　　2. 通過(guò)

9、腹腔注射的方式，對(duì)烏鱧注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物，研究其對(duì)烏鱧免疫活性指標(biāo)的影響。</p><p><b>　　擬解決的主要問(wèn)題：</b></p><p>　　1.諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖的提取方法。</p><p>　　2. 烏鱧免疫活性指標(biāo)的篩選及測(cè)定方法的建立。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：<

10、;/p><p><b>　　研究的方法:</b></p><p><b>　　1.試驗(yàn)用魚(yú)：烏鱧</b></p><p>　　2.試驗(yàn)用菌：鰤?mèng)~諾卡氏菌(Nacardia seriolea)</p><p>　　3.試劑與藥品：三氯乙酸（TCA）、胰蛋白酶磷酸緩沖液(3 mg/ mL 胰蛋白酶、0.1

11、mol/ L 磷酸緩沖液、pH 8.0)、肝素鈉、生理鹽水、白細(xì)胞稀釋液（冰醋酸1. 5 ml、1%龍膽紫1 ml、蒸餾水97.5ml）、溶壁微球菌( Microcrococcus lysodeikticus)、紅細(xì)胞稀釋液（NaCl 0. 5g、硫酸鈉2. 5g、氯化汞0. 25g、</p><p>　　蒸餾水加至100 ml）、溶壁微球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（牛肉浸膏1. 5g、蛋白胨2. 5g、NaCl 4. 0

12、g、瓊脂7. 5g、蒸餾水500mL、pH = 7. 4）、丙酮、乙醚等。</p><p>　　4.主要器材：玻璃缸、注射器、生化自動(dòng)分析儀、離心機(jī)、顯微鏡等</p><p><b>　　5. 實(shí)驗(yàn)方法：</b></p><p>　　5.1諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物的制備：</p><p>　　參考宋曉玲等（2005）改

13、進(jìn)的Park法。取離心洗滌得到的諾卡氏菌濕菌20g，懸浮于200mL 10 %三氯乙酸(TCA)溶液中，沸水浴20min以裂解菌體；冷卻后，1.2萬(wàn)r/ min 離心15 min，收集不含磷壁酸的細(xì)胞壁沉淀，蒸餾水洗滌沉淀3次；沉淀溶于胰蛋白酶磷酸緩沖液(3 mg/ mL 胰蛋白酶；0.1 mol/ L 磷酸緩沖液；pH 8.0)中，37 ℃水浴振蕩3h，以3000r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去未溶解的胰蛋白酶沉淀。上清液1.2萬(wàn)

14、r/min離心15 min，沉淀用蒸餾水洗2次，加入乙醚(除脂類物質(zhì))1.2萬(wàn)r/min離心15min，70 ℃干燥脫水后，即得淡褐色膠質(zhì)肽聚糖提取物。最后，將制備的肽聚糖干燥物用生理鹽水配成1%濃度的溶液，高溫高壓滅菌20min后備用。</p><p>　　5.2腹腔注射與血樣采集：</p><p>　　試驗(yàn)分對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組50尾魚(yú)。試驗(yàn)組腹腔注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物每尾0.

15、3mL，對(duì)照組以同量無(wú)菌生理鹽水注射。注射后分別于24h 、48h 、72h 、96h 、120h 、144h 、168h 時(shí)尾靜脈取血液樣本，每時(shí)間點(diǎn)每組取5 尾魚(yú)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。</p><p>　　用肝素鈉作為血液抗凝劑，臀鰭尾端基部無(wú)鱗處穿刺抽血, 取得全血，測(cè)定紅細(xì)胞數(shù)量、脆性及白細(xì)胞數(shù)量等生理指標(biāo)，當(dāng)天完成測(cè)定；用5mL針筒尾靜脈取血（不抗凝），全血制備血清，4 ℃靜置過(guò)夜，吸出血清后3 000r/

16、min 離心，用于溶菌酶等生化指標(biāo)的測(cè)定。</p><p>　　5.3溶壁微球菌粉末的制備：將溶壁微球菌涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，28 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜，用無(wú)菌重蒸水將溶壁微球菌菌落從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上洗下來(lái)，2 500r/ min 離心15min ，去上清，用4mL 丙酮洗滌后，2 500r/ min 離心3min，去上清，重復(fù)2 次，再用4mL 乙醚洗滌，2 500r/ min 離心3min，重復(fù)1 次，把溶壁微球菌從離心管

17、中取出，放到研缽中，于28 ℃下干燥3h，把結(jié)塊的細(xì)菌磨成粉末分裝到小離心管中,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　5.4免疫活性指標(biāo)的測(cè)定</p><p>　　5.4.1紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）：用紅細(xì)胞稀釋液將血液稀釋200倍，用Neubarner計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。</p><p>　　5.4.2白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）：用Türk稀釋液將血液稀釋20

18、0倍，用Neubarner計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。</p><p>　　5.4.3 紅細(xì)胞脆性( EOB): 將血液滴入濃度為0.20%～0.48% (梯度為0.02% )的NaCl溶液，以完全溶血的NaCl濃度作為紅細(xì)胞最大抵抗值。</p><p>　　5.4.4 溶菌酶活力測(cè)定：主要根據(jù)簡(jiǎn)紀(jì)常的方法進(jìn)行。用0. 067mol/ L PBS (pH 6. 4) 將溶壁微球菌配成0. 2mg

19、/ mL 的菌懸液，每個(gè)樣品取3mL 菌懸液，吸取40μL 血清加入到3mL 菌懸液中，混勻后立刻在540nm 下測(cè)定A0 值。然后在28 ℃水浴中溫浴30min，取出后置于4 ℃冰浴中以終止反應(yīng)，再測(cè)定A值，按公式計(jì)算溶菌酶的活力：U = (A0 - A) / A。</p><p>　　5.4.5 血清酶類的測(cè)定：堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)等在生化自動(dòng)分析儀上完成，具體方法

20、根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。</p><p>　　5.數(shù)據(jù)處理與分析：：</p><p>　　利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行測(cè)試取平均值，所有數(shù)據(jù)分析均采用單因素方差分析(one-factor analysis of variance)和Duncan檢驗(yàn)法。</p><p><b>　　技術(shù)路線: </b></

21、p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010年1月—2010年4月：</p><p>　　1.實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：查找資料，寫開(kāi)題報(bào)告和論文綜述；</p><p>　　2.儀器、藥品的準(zhǔn)備和各種實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備。</p><p>　　2010年5月—2010年12月：</p><

22、p>　　1. 諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖的分離提取。</p><p>　　2. 研究諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物對(duì)烏鱧免疫活性指標(biāo)的影響。</p><p><b>　　3、翻譯外文文獻(xiàn)。</b></p><p>　　2011年1月—2011年4月：</p><p>　　1、補(bǔ)充相關(guān)數(shù)據(jù)，整理試驗(yàn)結(jié)果；</p>

23、<p><b>　　2、撰寫論文初稿。</b></p><p>　　3、論文定稿，論文答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1]陳曉耘. 魚(yú)類的血液[J].重慶師專學(xué)報(bào), 2000,19(3):70-73.</p><p>　　[2]陳寅兒

24、,金珊,王國(guó)良. 鱸魚(yú)溶藻弧菌病的血液生理生化指標(biāo)研究[J]. 臺(tái)灣海峽, 2005,(01):104-108</p><p>　　[3]陳國(guó)勝,谷欣,張想竹.細(xì)菌肽聚糖及其應(yīng)用.安陽(yáng)工學(xué)院學(xué)報(bào).2007:36-38</p><p>　　[4]杜佳根.魚(yú)類諾卡氏菌病危害狀況與研究進(jìn)展. 遼寧省大連市大連水產(chǎn)學(xué)院,2007(5):27-31</p><p>　　[5]

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27、物學(xué)報(bào), 1979,(09):210-219</p><p>　　[11]米瑞芙,陶煩春,王曉梅,等. 鰱敗血癥血液生理指標(biāo)的變化[J]. 淡水漁業(yè),1993,23(4):16-19.</p><p>　　[12]米瑞芙.草魚(yú)、鯉和鰱血液學(xué)指標(biāo)的測(cè)定[J] . 淡水漁業(yè),1982(4):10-16.</p><p>　　[13]梅廣海,朱永生, 曹格,等. 越冬羅非

28、魚(yú)細(xì)菌性類結(jié)節(jié)病的初步研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2002 ,21(4):9-11.</p><p>　　[14]龐啟華,黃文芳,謝鳳. 豐產(chǎn)鯽細(xì)菌性敗血癥的血液病理變化[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2004.10(3):315-317</p><p>　　[15]宋曉玲,楊旭彤, 偲翰文,等.雙歧桿菌細(xì)胞壁肽聚糖的分離及其對(duì)兩種海產(chǎn)動(dòng)物免疫活性的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào).2005,29 (3):3

29、50-353.</p><p>　　[16]聞?dòng)衩?陸德源. 現(xiàn)代微生物學(xué). 第2版,上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社, 1992:1-2</p><p>　　[17]邢維賢,安利國(guó),傅榮恕.鯉魚(yú)豎鱗病的血液病理學(xué)研究.山東師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).1996 .12:84-86</p><p>　　[18]余毅,吳寶華.白鰱瘋狂病血液的研究[A].中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)第四次全國(guó)會(huì)員代

30、表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].1988,200- 203.</p><p>　　[19]袁思平, 王國(guó)良, 金珊. 養(yǎng)殖魚(yú)類致病諾卡氏菌研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2006,(02):137-141</p><p>　　[20]周玉,郭文場(chǎng),楊振國(guó),等. 魚(yú)類血液指標(biāo)研究的進(jìn)展[J] . 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001,10(2):163 -165.</p><p&

31、gt;　　[21]周玉,郭文場(chǎng),楊振國(guó),等.歐洲鰻鱺”狂游病”血液生化指標(biāo)研究[J].水生生物學(xué)報(bào), 2002,26(3):314-316.</p><p>　　[22]Takashi S. ,Fukami S. , Shigeo Namioka. Ehanced resistance of mice to Escheriehia coli infection induced by administration

32、of Peptidoglycan derived from Bidoaoteriun thermo phylum[J]. Vet . Medical Sci . , 1994.56 :433</p><p>　　[23]Itami T. , Kondo M. Uozu M.et al.Enhancement of disease resistance against Enterococcus seriolicid

33、a infection in yellowtail Seriola quinqueradiata Temminck and Schlegel by oral administration of Peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum[J]. J . Fish Dis . 1996.19:185-187</p><p>　　[24]Itami

34、T , Masaya A. Enhancement of disease resistance of kuruma shrimp ,penaeus japonicus after oral administration of peptidoglican derived from Bif idobacterium thermophilum[J]. Aquacuture。1998. 164:277-288</p><p&

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36、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　水產(chǎn)養(yǎng)殖</b></p><p>　　魚(yú)類血液指標(biāo)的主要功能及研究概況</p><p>　　摘要：血液是具有活體組織所固有特性的一種結(jié)締組織，承擔(dān)著體內(nèi)運(yùn)輸、防御、免疫、體液調(diào)節(jié)及維持內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的功能。當(dāng)魚(yú)體受到病菌感染而引起疾病并

37、發(fā)生生理或病理變化時(shí), 必定會(huì)引起其血液生理生化指標(biāo)的變化。本文綜述了魚(yú)類的主要血液指標(biāo)、功能及疾病、免疫增強(qiáng)劑等因素對(duì)魚(yú)類血液指標(biāo)的影響，以期為魚(yú)類疾病致病機(jī)理及免疫防病的研究提供理論參考。</p><p>　　關(guān)鍵詞：魚(yú)類；血液指標(biāo)；疾??；免疫增強(qiáng)劑</p><p>　　血液是具有活體組織所固有特性的一種結(jié)締組織，承擔(dān)著體內(nèi)運(yùn)輸、防御、免疫、體液調(diào)節(jié)及維持內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的功能。其主要的

38、成分為血漿、血細(xì)胞。血液中含有各種營(yíng)養(yǎng)成分，如無(wú)機(jī)鹽、氧、以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物、激素、酶和抗體等，有營(yíng)養(yǎng)組織、調(diào)節(jié)器官活動(dòng)和防御有害物質(zhì)的作用[1]。一般情況下，血液的調(diào)節(jié)能力是不強(qiáng)的，有時(shí)它的組成和結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，而這種變化通常是病理性的。當(dāng)魚(yú)體受到病菌感染而引起疾病并發(fā)生生理或病理變化時(shí)，必定與其血液生理生化指標(biāo)變化有密切的關(guān)系[2]。因此，動(dòng)物血液的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)魚(yú)類的健康與否、營(yíng)養(yǎng)狀況及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)程度。&

39、lt;/p><p>　　1 魚(yú)類血液的主要生理生化指標(biāo)及其功能</p><p>　　1.1 魚(yú)類血液的主要生理指標(biāo)及其功能</p><p>　　魚(yú)類血液生理指標(biāo)主要有紅細(xì)胞數(shù)RBC、白細(xì)胞數(shù)WBC、血紅蛋白Hb、紅細(xì)胞比容HCT、紅細(xì)胞沉降率ESR、紅細(xì)胞脆性EOB等。紅細(xì)胞也稱紅血球，是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，同時(shí)也是脊椎動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)血液運(yùn)送氧氣的最主要的媒介。血

40、紅蛋白是脊椎動(dòng)物紅血細(xì)胞的一種含鐵的復(fù)合變構(gòu)蛋白，由血紅素和珠蛋白結(jié)合而成，其功能是運(yùn)輸氧和二氧化碳，維持血液酸堿平衡。紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量是與機(jī)體呼吸和供氧狀況緊密有關(guān)的指標(biāo)[3]，當(dāng)魚(yú)體受到病菌感染后，其正常生理活動(dòng)發(fā)生紊亂，其紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞比容等都會(huì)發(fā)生明顯的變化。魚(yú)類白細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)變化，也在一定程度上反映其造血機(jī)能及疾病的情況。當(dāng)病原人侵機(jī)體時(shí)，刺激造血機(jī)能和體液防御機(jī)能相對(duì)增強(qiáng)，白細(xì)胞數(shù)相對(duì)增加，其中的

41、顆粒細(xì)胞和單核細(xì)胞增加明顯。而當(dāng)疾病進(jìn)人后期，魚(yú)體造血機(jī)能和體液防御機(jī)能就會(huì)相應(yīng)減弱，此時(shí)的白細(xì)胞數(shù)量也隨之減少，并呈老化現(xiàn)象。紅細(xì)胞沉降率是指紅細(xì)胞在一定條件下的沉降速度。一般情況下，健康機(jī)體的血沉數(shù)值波動(dòng)于一個(gè)較狹窄范圍內(nèi)，但在許多病理情況下，血沉就會(huì)明顯下降。紅細(xì)胞脆性是指引起紅細(xì)胞全部溶血的NaCl濃度，一般而言，新生紅細(xì)</p><p>　　1.2 魚(yú)類血液的主要生化指標(biāo)及其功能</p>

42、<p>　　魚(yú)類血液生化指標(biāo)主要有谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、乳酸脫氫酶LDH、總蛋白TP、尿素BUN、肌酐Cr、總膽固醇CHO、血糖GLU，溶菌酶活性以及K+、Na+、Cl-等。谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶等血清酶類主要分布于機(jī)體的肝、腎、肌肉等組織細(xì)胞中，在正常情況下血清中這些酶活性低且相對(duì)恒定，并參與和控制機(jī)體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)的代謝。當(dāng)魚(yú)感染疾病后，血清中這些酶類的活性就會(huì)大大增強(qiáng)，預(yù)示機(jī)體的肝、腎

43、、肌肉等主要器官組織細(xì)胞發(fā)生病變，細(xì)胞內(nèi)酶釋出?？偟鞍准囱蹇偟鞍?，是血清固體成分中含量最多的物質(zhì)，主要是由肝臟合成的；總膽固醇是指血液中所有脂蛋白所含膽固醇之總和，包括游離膽固醇和膽固醇酯，肝臟也是其合成和貯存的主要器官；而血糖在血清中的含量也與肝臟密切相關(guān)。因此，總蛋白、總膽固醇和血糖都是反映肝臟功能的重要指標(biāo)。Marja等[5]研究表明，在一定程度上，血漿中溶菌酶活性變化與循環(huán)系統(tǒng)中白細(xì)胞數(shù)目變化相一致，白細(xì)胞數(shù)目多，溶菌酶活性就

44、增加，兩者正相關(guān)。尿素、肌酐、K+、Na+、Cl-等的含量則是腎功能的參考指標(biāo)[3,6,7]。腎功能的衰竭，腎單位濾過(guò)與重吸收功能的失調(diào)會(huì)引起</p><p>　　2 疾病對(duì)魚(yú)類血液指標(biāo)的影響 </p><p>　　國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)魚(yú)類血液學(xué)的研究做了很多工作。眾多的研究資料表明，魚(yú)類的血液學(xué)指標(biāo)值與魚(yú)的種類、生活環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、性別、健康狀況、疾病種類等有關(guān)[2,3,8]。如一些學(xué)者觀察到饑餓時(shí)

45、魚(yú)類血液中紅細(xì)胞數(shù)量會(huì)減少[9-11]，林光華[9]曾報(bào)道饑餓時(shí)紅細(xì)胞大小的變化，許多學(xué)者都發(fā)現(xiàn)魚(yú)類紅細(xì)胞數(shù)隨季節(jié)變化明顯等[12-14]。余毅[15]及米瑞芙[16]等的研究表明，患瘋狂病的鰱其TP和UGLU明顯降低，而患敗血癥鰱其TP、ALB明顯降低，BUN、肌酸酐(CREA)、P、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)等顯著升高，球蛋白(GLB)、GPT、甘油三酯(TG)、AChE的差異不顯著；患敗血癥和狂游癥的鰱白細(xì)胞數(shù)目都明顯增多，血漿中K、C

46、l離子也均明顯增高。陳福華等[17]關(guān)于赤點(diǎn)石斑魚(yú)增生性腎臟病的研究認(rèn)為，當(dāng)病原人侵魚(yú)體時(shí)，刺激造血機(jī)能和體液防御機(jī)能相對(duì)增強(qiáng)，白細(xì)胞數(shù)會(huì)相對(duì)增加；而當(dāng)疾病進(jìn)入后期，造血機(jī)能和體液防御機(jī)能也相應(yīng)減弱，此時(shí)的白細(xì)胞數(shù)量會(huì)隨之減少。朱心玲等[18]研究患出血病的草魚(yú)表明，白蛋白和膽固醇的變化在潛伏期和發(fā)展期并不相同，白蛋白在潛伏期為顯著的增加，而在發(fā)展期為明顯的降低；膽固醇在潛伏期無(wú)變</p><p>　　3 免疫增

47、強(qiáng)劑對(duì)魚(yú)類血液指標(biāo)的影響 </p><p>　　免疫增強(qiáng)劑，是一類通過(guò)不同方式達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫力的免疫治療藥物，如增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的功能、提高細(xì)胞免疫或促進(jìn)體液免疫功能等。免疫增強(qiáng)劑按其作用分為免疫佐劑、免疫恢復(fù)劑和免疫替代劑[23]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于魚(yú)類免疫增強(qiáng)劑的研究報(bào)道很多，目前研究報(bào)道過(guò)的免疫增強(qiáng)劑主要有:左旋咪唑、FK-565、MDP、β-葡聚糖、肽聚糖，脂多糖、寡糖、甲殼質(zhì)、甲殼胺、VC以及VE等[24]。研究

48、表明，免疫增強(qiáng)劑能引起魚(yú)類血液指標(biāo)的變化，通過(guò)作用于魚(yú)體非特異性免疫因子來(lái)提高魚(yú)類的抗病力。如劉云等[25]報(bào)道了免疫增強(qiáng)劑（甲殼胺）能提高血液中白細(xì)胞數(shù)量和吞噬能力，增強(qiáng)鯽魚(yú)血清中酚氧化酶的活性，且對(duì)鯽魚(yú)的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。鄧時(shí)銘等[26]證實(shí)了蛭弧菌微生態(tài)制劑在鯽魚(yú)體內(nèi)主要對(duì)頭腎產(chǎn)生顯著作用，能提高鯽魚(yú)的非特異性免疫。劉勇等[27]研究發(fā)現(xiàn)免疫增強(qiáng)劑可使河鯽魚(yú)血液中白細(xì)胞吞噬活性、血清和體液粘液的溶菌酶活性顯著提高。陳昌福等[28]研

49、究表明,在飼料中添加適量的免疫多糖(酵母細(xì)胞壁) 能夠增強(qiáng)異育銀鯽非特異性免疫功能，試驗(yàn)組異育銀鯽白細(xì)胞吞噬活性均顯著高于對(duì)照組。</p><p><b>　　4 展望</b></p><p>　　隨著集約化養(yǎng)殖技術(shù)的應(yīng)用，養(yǎng)殖規(guī)模突飛猛進(jìn)，然而制約養(yǎng)殖生產(chǎn)的問(wèn)題也日益突出。水環(huán)境污染、高密度養(yǎng)殖等不可避免地影響?zhàn)B殖魚(yú)類的健康，使其感染疾病的機(jī)率大大提高，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害

50、頻繁發(fā)生，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，通過(guò)提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力來(lái)抵抗疾病的發(fā)生已成為研究熱點(diǎn)?？股丶盎瘜W(xué)藥品的使用會(huì)使魚(yú)類疾病的病原生物抗藥性增強(qiáng)，并對(duì)生態(tài)環(huán)境造成污染，因此，深入研究水產(chǎn)動(dòng)物免疫機(jī)理以及通過(guò)使用合適的免疫增強(qiáng)劑來(lái)增強(qiáng)養(yǎng)殖魚(yú)類免疫防御力，將會(huì)是魚(yú)類病害防治研究的趨勢(shì)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 陳曉耘.

51、魚(yú)類的血液[J].重慶師專學(xué)報(bào),2000,19(3):70-73.</p><p>　　[2] 卓孝磊,梁日深,梁桂洪,等.月鱧、烏鱧和斑鱧血液指標(biāo)、血細(xì)胞比較分析[J].科技導(dǎo)報(bào)2008,26(13):85-87.</p><p>　　[3] 周玉,郭文場(chǎng),楊振國(guó),等.魚(yú)類血液學(xué)指標(biāo)研究的進(jìn)展[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,10(2):163-165. </p>&

52、lt;p>　　[4] 金珊,王國(guó)良,趙青松,等.鱸細(xì)菌性類結(jié)節(jié)病的病原及血液病理研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2004,28(6):703-708.</p><p>　　[5] Marjam,Antti S. Changes in plasma lysozyme and blood leucocyte levels of hatchery - reared Atlantic Salmon and sea tro

53、ut during parr-smolt transformation[J]. Aquaculture,1992,106:75-87.</p><p>　　[6] 周玉,郭文場(chǎng),楊振國(guó),等.歐洲鰻鱺”狂游病”血液生化指標(biāo)研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2002,26(3):314-316. </p><p>　　[7] 尾崎久雄.魚(yú)類血液與循環(huán)生理[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1982:

54、59,74-92,89.</p><p>　　[8] 袁仕取,張永安,姚衛(wèi)建,等. 鱖魚(yú)外周血細(xì)胞顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)的觀察[J].水生生物學(xué)報(bào),1998,22(1):39-45.</p><p>　　[9] 林光華.鯉魚(yú)血液的研究[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),1979,25(9):210-219</p><p>　　[10] 米瑞芙.草魚(yú)、鯉和鰱血液學(xué)指標(biāo)的測(cè)定[J].淡水漁

55、業(yè),1982(4):10-16.</p><p>　　[11] 羅貫一.黃鱔血液的實(shí)驗(yàn).魚(yú)類學(xué)論文集(第三輯)[M].科學(xué)出版社.1983:69-75.</p><p>　　[12] 沈曉民,華苒.團(tuán)頭魴九項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)的正常值[J].動(dòng)物學(xué)雜志,1990,25(1):3-6.</p><p>　　[13] 朱心玲,賈麗珠,張明瑛.草魚(yú)血液學(xué)的研究.I.九項(xiàng)血液常數(shù)的

56、周年變化[J].水生生物學(xué)報(bào),1991,9(3):248-256.</p><p>　　[14] 林光華,張豐旺,翁世聰. 草魚(yú)血液的研究[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),1985,31(4):336-343.</p><p>　　[15] 余毅,吳寶華.白鰱瘋狂病血液的研究[A].中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)第四次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].1988,200-203.</p><p>

57、;　　[16] 米瑞芙,陶煩春,王曉梅,等.鰱敗血癥血液生理指標(biāo)的變化[J].淡水漁業(yè),1993,23(4):16-19.</p><p>　　[17] 陳福華,陳畢生,楊鶯鶯,等.赤點(diǎn)石斑魚(yú)增生性腎臟病的血液病理觀察[J].熱帶海洋,1997,16(3):49-53.</p><p>　　[18] 朱心玲,賈麗珠,張明瑛.草魚(yú)出血病潛伏期和發(fā)展期的血液病理研究[J].水生生物學(xué)報(bào),198

58、7,11(1):59-66.</p><p>　　[19] 張永嘉,吳澤陽(yáng),許其爵,等.網(wǎng)箱養(yǎng)殖羅非魚(yú)綜合癥的血清分析[J].水利漁業(yè),1994,(2):8,9,47.</p><p>　　[20] 陳寅兒,金珊,王國(guó)良.鱸魚(yú)溶藻弧菌病的血液生理生化指標(biāo)研究[J].臺(tái)灣海峽, 2005,24(1):104-108.</p><p>　　[21] 邢維賢,安利國(guó),傅榮

59、恕.鯉魚(yú)豎鱗病的血液病理學(xué)研究[J].山東師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1996,11(4):84-86.</p><p>　　[22] 龐啟華,黃文芳,謝鳳.豐產(chǎn)鯽細(xì)菌性敗血癥的血液病理變化[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2004,10(3):315-317.</p><p>　　[23] 謝少文.中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書-免疫學(xué)[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.1983:37-38.</p>&

60、lt;p>　　[24] Masahiro S.Current research status of fishi immunostimulants[J]. Aquaculture,1999,172:63-92.</p><p>　　[25] 劉云,孫峰,王丹.免疫增強(qiáng)劑對(duì)鯽魚(yú)非特異性免疫功能的影響[J].海洋科學(xué),2004,28(9):42-45.</p><p>　　[26] 鄧時(shí)銘

61、,謬伏初,黃華偉,等.蛭弧菌微生態(tài)制劑對(duì)鯽非特異性免疫的影響[J].科學(xué)養(yǎng)魚(yú),2009,(7):54-55.</p><p>　　[27] 劉勇,賈永紅.免疫增強(qiáng)劑對(duì)河鯽魚(yú)白細(xì)胞吞噬和溶菌酶活性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2007,35(1):111-113.</p><p>　　[28] 陳昌福,吳凡,熊傳喜,等.免疫多糖(酵母細(xì)胞壁)對(duì)受免異育銀鯽免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用[J].淡水漁業(yè),2

62、004,6(4):55-57.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物對(duì)烏鱧免疫活性的影響</p><p><b>　　目錄</b></p><p

63、><b>　　1引言16</b></p><p>　　2 材料與方法16</p><p><b>　　2.1材料17</b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種17</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)17</p><p>　　2.1.3實(shí)驗(yàn)用水1

64、7</p><p>　　2.1.4 藥品和試劑17</p><p>　　2.2 試驗(yàn)方法17</p><p>　　2.2.1 溶壁微球菌懸液的制備17</p><p>　　2.2.2肽聚糖注射液的制備17</p><p>　　2.2.3注射實(shí)驗(yàn)17</p><p>　　2.2.4 血清

65、、血細(xì)胞樣本的采集17</p><p>　　2.2.5血細(xì)胞脆性（EOB）的測(cè)定17</p><p>　　2.2.6血細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBS）17</p><p>　　2.2.7溶菌酶活力的測(cè)定18</p><p>　　2.2.8血液生化指標(biāo)的測(cè)定18</p><p>　　2.3數(shù)據(jù)分析18</p>

66、<p><b>　　3 結(jié)果18</b></p><p>　　3.1諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血液生理指標(biāo)的影響18</p><p>　　3.1.1諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞數(shù)量的影響18</p><p>　　3.1.2諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞脆性的影響18</p><p>　　3.1.

67、3 諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧溶菌酶活力的影響19</p><p>　　3.2諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血液生化指標(biāo)的影響19</p><p>　　3.2.1 血清總蛋白TP20</p><p>　　3.2.2 血清白蛋白ALB20</p><p>　　3.2.3 堿性磷酸酶ALP21</p><p>　　3

68、.2.4 尿素氮BUN21</p><p>　　3.2.5 乳酸脫氫酶LDH22</p><p>　　3.2.6 乳酸脫氫酶同工酶LDH122</p><p><b>　　4 討論23</b></p><p>　　4.1 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物血細(xì)胞數(shù)量和血細(xì)胞脆性的影響23</p><p>

69、;　　4.2 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶活力的影響23</p><p>　　4.3免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物血清總蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）的影響23</p><p>　　4.4 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物堿性磷酸酶（ALP）的影響24</p><p>　　4.5 免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物尿素氮（BUN）的影響24</p><p>　　4.6免疫多糖

70、對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物乳酸脫氫酶（LDH）和乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）的影響24</p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)25</b></p><p>　　摘要：采用濃度為16.7mg/mL的鰤?mèng)~諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物對(duì)烏鱧進(jìn)行腹腔注射，于實(shí)驗(yàn)24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h時(shí)

71、取其血液測(cè)定血細(xì)胞數(shù)目、血細(xì)胞脆性（EOB）、溶菌酶活力（LSZ）、血清總蛋白（TP）含量、血清白蛋白(ALB)含量、堿性磷酸酶（ALP）活性、尿素氮（BUN）含量、乳酸脫氫酶（LDH）活性以及乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）等與烏鱧免疫力相關(guān)的血液生理指標(biāo)和生化指標(biāo)，結(jié)果表明：鰤?mèng)~諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖使烏鱧血細(xì)胞數(shù)目和血細(xì)胞脆性均有增加，但影響不顯著（P>0.05）；溶菌酶活力、血清總蛋白和血清白蛋白在48h時(shí)顯著上升（P<0

72、.05）；堿性磷酸酶ALP活性與對(duì)照組相比，均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且差異性顯著（P<0.05）；尿素氮水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)96 h后保持相對(duì)穩(wěn)定；乳酸脫氫酶活性和乳酸脫氫酶同工酶均在72h時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），說(shuō)明鰤?mèng)~諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖能夠增強(qiáng)烏鱧的免疫活性。</p><p>　　關(guān)鍵詞：諾卡氏菌；肽聚糖；烏鱧；血液生理指標(biāo)；血液生化指標(biāo)</p>

73、;<p>　　Abstract:With 16.7g/mL of Yellowtail Nocardia cell wall peptidoglycan intraperitoneal injection for argus, at 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h after the experimental collect blood to determine the Red b

74、lood cell count, blood cell fragility(EOB), Lysozyme activity(LSZ), serum total protein (TP), serum albumin(ALB), alkaline phosphatase(ALP), blood urea nitrogen (BUN), lactate dehydrogenase (LDH), lactate dehydrogenase i

75、soenzyme (LDH1) and other physiological and biochemical indexes of blood r</p><p><b>　　朗讀</b></p><p>　　顯示對(duì)應(yīng)的拉丁字符的拼音</p><p><b>　　字典</b></p><p>　　

76、Key words: Nocardia; peptidoglycan; Ophicephalus argus; blood physiological parameters; blood biochemical parameters</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　諾卡氏菌（Nocardia）為革蘭氏陽(yáng)性菌，好氧，分類上屬細(xì)菌域，厚壁菌

77、門，放線菌綱，放線菌目，諾卡氏菌科。菌體呈長(zhǎng)或短桿狀, 或細(xì)長(zhǎng)分枝狀，常斷裂成桿狀至球狀體，基絲發(fā)達(dá)，呈分枝狀，氣絲較少。魚(yú)類諾卡氏菌病于1963年在全球首次報(bào)告，確認(rèn)于阿根廷熱帶養(yǎng)殖的虹彩脂魚(yú)（Hyphessobrycon innesi）[1]。隨后此病又陸續(xù)發(fā)生在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、黃尾鰤（Seriola lalandi）、烏鱧、大西洋牡蠣（Crassostrea gigas）、大口鱸（Micropter

78、us salmoides）和海鱸（Lateolabrax japonicus）等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中，曾影響日本、美國(guó)、澳大利亞、加拿大等地的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，造成很大經(jīng)濟(jì)損失[2]。該病曾是日本水產(chǎn)養(yǎng)殖中最主要的水產(chǎn)動(dòng)物疾病之一，也是大西洋牡蠣養(yǎng)殖的主要疾病。而該病近年來(lái)對(duì)我國(guó)大陸和臺(tái)灣水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也產(chǎn)生了較大影響，先后在烏鱧、大口鱸、海鱸、大黃魚(yú)等養(yǎng)殖魚(yú)類中發(fā)生此病[3]。</p><p>　　肽聚糖( peptidogl

79、ycan) 又稱粘肽、胞壁質(zhì)或粘質(zhì)復(fù)合物，由雙糖單位，四肽尾還有肽橋聚合而成，是N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAMA）交替連接的雜多糖與不同組成的肽交叉連接形成的多層網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)。其是一種多糖與氨基酸相連的多糖復(fù)合物，由于此復(fù)合物中氨基酸鏈不像蛋白質(zhì)中的那樣長(zhǎng)，故稱肽聚糖。肽聚糖是許多細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，不同的肽聚糖中出現(xiàn)的氨基酸數(shù)是有限的，亞肽單位及間肽橋上氨基酸的組成及排列上的不同，決定了肽聚糖種類的多樣性[4]

80、。近年來(lái)的大量的研究結(jié)果表明，肽聚糖具有包括佐劑活性在內(nèi)的多種生物活性。肽聚糖能對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，是一種免疫系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)劑。肽聚糖能夠刺激B、T 淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫，激活單核細(xì)胞及多核白細(xì)胞的吞噬活性，活化補(bǔ)體[5]，其分子中的多糖成分還具有抗腫瘤，抗感染能力[6]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中投喂肽聚糖后發(fā)現(xiàn)，其能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物如五條鰤[7]、斑節(jié)對(duì)蝦[8]、日本對(duì)蝦[9]等抗病力和成活率。因此

81、，使用肽聚糖有利于解決水產(chǎn)養(yǎng)殖中大量使用抗生素藥物防治病害所表現(xiàn)出的生物抗藥性問(wèn)題及食品的藥</p><p>　　烏鱧（Ophicephalus argus），亦稱黑魚(yú)，屬鱸形目，攀鱸亞目，鱧科，鱧屬，體呈烏黑色，細(xì)長(zhǎng)，前部圓筒狀，后部側(cè)扁，由背至腹顏色逐漸變淺，圓鱗。烏鱧分布極為廣泛，除西部高原地區(qū)外，從黑龍江至海南的河川、湖泊、水庫(kù)、池塘等各種類型的水體中均有發(fā)現(xiàn)，國(guó)外產(chǎn)于朝鮮西、南部。烏鱧肉質(zhì)鮮美，富含蛋白

82、質(zhì)、脂肪、18種氨基酸等，還含有人體必需的鈣、磷、鐵及多種維生素，營(yíng)養(yǎng)豐富、肉味甘性溫且骨刺少，有補(bǔ)脾、利水的藥用功能，深受群眾的歡迎。烏鱧是一種適應(yīng)性強(qiáng)、對(duì)不良水溫、水質(zhì)及缺氧條件有較強(qiáng)耐受力的魚(yú)類，在江河湖塘等自然環(huán)境中很少發(fā)病。但隨著烏鱧人工高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，由于養(yǎng)殖密度過(guò)高，養(yǎng)殖區(qū)域水質(zhì)惡化嚴(yán)重，以及烏鱧經(jīng)過(guò)多代人工繁育造成種質(zhì)退化，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降等原因，烏鱧的病害時(shí)有發(fā)生，且呈現(xiàn)出種類多、流行范圍廣、防治效果不明顯等特點(diǎn)，

83、給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失，也對(duì)烏鱧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展起著嚴(yán)重的阻礙作用。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以烏鱧為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)烏鱧人工注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物，研究其對(duì)烏鱧免疫活性指標(biāo)的影響，為烏鱧諾卡氏菌病的防治提供理論參考。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1材料<

84、/b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種 </p><p>　　鰤?mèng)~諾卡氏菌（Nacardia seriolea）、溶壁微球菌（Microcrococcus lysodeikticus）。</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)</p><p>　　烏鱧（O.argus )購(gòu)自寧波水產(chǎn)市場(chǎng)，體重400~500g，體長(zhǎng)約30cm

85、，共40尾。經(jīng)高錳酸鉀全身消毒后，分成2組，分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。暫養(yǎng)于室內(nèi)大塑料桶中并用遮陽(yáng)布遮蓋，以保持適宜的環(huán)境暗度。根據(jù)水質(zhì)情況每天適時(shí)換水1~2次，每次換水1/3。定時(shí)定量投喂小魚(yú)，及時(shí)吸出殘餌和糞便，保持水質(zhì)的清潔。</p><p>　　2.1.3實(shí)驗(yàn)用水 </p><p>　　實(shí)驗(yàn)用水為充分曝氣處理的自來(lái)水，試驗(yàn)期間使用充氧泵持續(xù)充氧。</p><p>

86、;　　2.1.4 藥品和試劑 </p><p>　　血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）、乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）等試劑盒購(gòu)自美康生物科技有限公司；0.067mol/L磷酸緩沖液（KH2PO4 73mL，0.067mol/L K2HPO4 27mL，NaCl 0.5g，pH 6.4）；0.75%的生理鹽水；鰤?mèng)~諾卡氏菌肽聚糖（本研究室自制）。

87、</p><p><b>　　2.2 試驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 溶壁微球菌懸液的制備 </p><p>　　將溶壁微球菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用0.067mol/L PBS（pH 6.4）將溶壁微球菌從營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上洗下，配成0.2mg/mL的菌懸液（在570nm處的吸光值為A=0.4

88、00），備用。</p><p>　　2.2.2肽聚糖注射液的制備 </p><p>　　取鰤?mèng)~諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖粗提物0.25g溶于15ml的0.75%生理鹽水中，制成濃度為0.0167g/mL的肽聚糖注射液。</p><p>　　2.2.3注射實(shí)驗(yàn) </p><p>　　采用腹部注射的方法將已配好的肽聚糖溶液注射到實(shí)驗(yàn)組魚(yú)體內(nèi)，每尾

89、注射0.5ml，對(duì)照組注射同量無(wú)菌生理鹽水。注射后分別在24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h時(shí)每組取魚(yú)3尾，抽取其血液樣本，用以各項(xiàng)血液指標(biāo)的檢測(cè)。</p><p>　　2.2.4 血清、血細(xì)胞樣本的采集 </p><p>　　將烏鱧側(cè)放平躺于解剖盤中，尾部穿刺靜脈采血后，一部分放置于離心管中4℃靜置過(guò)夜，經(jīng)3000r/min離心后吸出血清，用于溶菌酶活力和各項(xiàng)

90、生化指標(biāo)的測(cè)定；另一部分用無(wú)菌肝素鈉抗凝，用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血細(xì)胞脆性的測(cè)定，當(dāng)天完成。</p><p>　　2.2.5血細(xì)胞脆性（EOB）的測(cè)定</p><p>　　配置系列濃度為0.17%~0.45%（梯度為0.02%）的NaCl溶液放入若干支試管中并編號(hào)，取血后立即向各試管中滴入一滴血并揉搓混勻，室溫下放置2小時(shí)后觀察結(jié)果，以完全溶血的NaCl濃度作為紅細(xì)胞最大抵抗值，即紅細(xì)胞的最小

91、脆性。</p><p>　　2.2.6血細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBS）</p><p>　　按Neubuer氏改良方法進(jìn)行。用5mL移液槍準(zhǔn)確吸取3.98mL紅細(xì)胞稀釋液于干凈試管內(nèi)，然后用毛細(xì)吸管吸20μl血放入試管底部，輕輕搖振試管1~2min，以混勻稀釋的血液，然后用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。</p><p>　　2.2.7溶菌酶活力的測(cè)定</p><p&g

92、t;　　根據(jù)簡(jiǎn)紀(jì)常[10]的方法進(jìn)行。吸取40uL血清加入到3mL溶壁微球菌菌懸液中，均勻混合后立刻在540nm下測(cè)定A0值；然后在28℃水浴中溫浴30min，取出后置于4℃冰浴中以終止反應(yīng)，再測(cè)定A值；最后按公式計(jì)算溶菌酶活力：U=(A0-A)/A。</p><p>　　2.2.8血液生化指標(biāo)的測(cè)定 </p><p>　　血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）

93、、尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）、乳酸脫氫酶同工酶1（LDH1）等的測(cè)定均在日立7020全自動(dòng)生化儀上完成，具體方法根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。</p><p><b>　　2.3數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　所得結(jié)果均以3個(gè)平行組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SE)表示；所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 13.0 (Statiscal Pack

94、age for the Social Science) 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-factor analysis of variance)和均值多重比較分析(LSD法)。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血液生理指標(biāo)的影響</p><p>　　3.1.1諾卡氏菌細(xì)胞壁肽

95、聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞數(shù)量的影響</p><p>　　烏鱧注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后血細(xì)胞數(shù)目的變化情況見(jiàn)圖1。由圖1可知，烏鱧在注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后，實(shí)驗(yàn)144h內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組血細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比都有增加，但均不存在顯著性差異（P>0.05）。</p><p>　　圖1肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞數(shù)量的影響</p><p>　　Fig.1 Effects of pep

96、tidoglycan on the Red blood cell count of Ophicephalus argus</p><p>　　3.1.2諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞脆性的影響</p><p>　　烏鱧注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后血細(xì)胞脆性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)48h后實(shí)驗(yàn)組烏鱧血細(xì)胞脆性比對(duì)照組均略有增大，但差異不顯著（P>0.05）。</p&g

97、t;<p>　　圖2 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血細(xì)胞脆性的影響</p><p>　　Fig.2 Effects of peptidoglycan on the blood cell fragility of Ophicephalus argus</p><p>　　3.1.3 諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧溶菌酶活力的影響</p><p>　　注射

98、諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后，烏鱧血液溶菌酶活力的變化情況見(jiàn)圖3。由圖3可知，實(shí)驗(yàn)48h時(shí)實(shí)驗(yàn)組溶菌酶活力與對(duì)照組相比有顯著增強(qiáng)（P<0.05）；其它實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖3 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧溶菌酶活力的影響</p><p>　　Fig.3 Effects of peptidoglycan on the Lysozyme act

99、ivity of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血液生化指標(biāo)的影響</p><p>　　3.2.1 血清總蛋白TP</p><p>　　圖4為烏鱧注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后血清總蛋白TP的變化情況。由圖4可

100、知，在實(shí)驗(yàn)48h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組烏鱧血清總蛋白含量迅速增高并顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但其后逐漸降低，與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖4 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血清總蛋白TP的影響</p><p>　　Fig.4 Effects of peptidoglycan on the serum total protein of Ophicepha

101、lus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.2 血清白蛋白ALB</p><p>　　注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后，烏鱧血液血清白蛋白ALB的變化情況見(jiàn)圖5。由圖5可知，烏鱧在注射肽聚糖后，其血清白蛋白含量有增高趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)48h時(shí)顯著大于對(duì)照組（P<0.05），但其它實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)差異

102、性不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖5 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧血清白蛋白ALB的影響</p><p>　　Fig.5 Effects of peptidoglycan on the serum albumin of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P>0.05）<

103、/p><p>　　3.2.3 堿性磷酸酶ALP</p><p>　　注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧堿性磷酸酶ALP活性的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶ALP活性與對(duì)照組相比，均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)24h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶活性最大，實(shí)驗(yàn)24h、48h、96h、144h、168h時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）。</p><p>　　

104、圖6 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧堿性磷酸酶ALP活性的影響</p><p>　　Fig.6 Effects of peptidoglycan on the alkaline phosphatase of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.4 尿素氮BU

105、N</p><p>　　圖7為烏鱧注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后尿素氮BUN含量的變化情況。由圖7可知，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組烏鱧尿素氮水平逐漸低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)96h后保持相對(duì)穩(wěn)定，且均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。</p><p>　　圖7 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧尿素氮BUN的影響</p><p>　　Fig.7 Effects of pepti

106、doglycan on the blood urea nitrogen of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.5 乳酸脫氫酶LDH</p><p>　　注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧乳酸脫氫酶LDH活性的影響見(jiàn)圖8。由圖8可知，在實(shí)驗(yàn)72h內(nèi)烏鱧血液乳酸脫

107、氫酶活性逐漸增強(qiáng)，72h時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；其后逐漸降低，并一直處于對(duì)照組水平附近，差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖8 注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖對(duì)烏鱧乳酸脫氫酶LDH的影響</p><p>　　Fig.8 Effects of peptidoglycan on the lactate dehydrogenase of Ophice

108、phalus argus</p><p>　　*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.6 乳酸脫氫酶同工酶LDH1</p><p>　　圖9為注射諾卡氏菌細(xì)胞壁肽聚糖后對(duì)烏鱧乳酸脫氫酶同工酶1LDH1活性的影響。由圖9可知，在72h時(shí)實(shí)驗(yàn)組烏鱧血液乳酸脫氫酶同工酶活性最強(qiáng)，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；其它實(shí)驗(yàn)