甲殼類WAP結(jié)構(gòu)域蛋白及Bax抑制因子1樣蛋白的表達(dá)與功能研究.pdf

1、作為重要的甲殼類動(dòng)物,中國(guó)明對(duì)蝦和克氏原螯蝦是研究無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)良好的實(shí)驗(yàn)材料。通過(guò)對(duì)先天免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的研究,有助于進(jìn)一步弄清楚甲殼類抗菌以及抗病毒的免疫機(jī)理,為蝦類病害的預(yù)防以及控制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持；同時(shí),也有助于無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫理論的進(jìn)一步完善。本研究選擇了中國(guó)明對(duì)蝦具有雙WAP結(jié)構(gòu)域蛋白基因、克氏原螯蝦具有單個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域蛋白基因以及克氏原螯蝦Bax抑制因子1樣蛋白基因進(jìn)行研究,得到了如下結(jié)果。
　　

2、1.中國(guó)明對(duì)蝦DWD基因的表達(dá)和功能研究
　　 我們擴(kuò)增到了中國(guó)明對(duì)蝦具有雙WAP結(jié)構(gòu)域蛋白的cDNA序列,序列全長(zhǎng)為787 bp,開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為354 bp,編碼117個(gè)氨基酸。成熟肽具有101個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)的分子量為12.78 kDa,理論等電點(diǎn)為8.49。氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的C端存在兩個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域中存在保守的8個(gè)半胱氨酸殘基。在轉(zhuǎn)錄水平上,Fc-DWD在血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、鰓、胃、腸中都有分布；而且在病毒

3、和細(xì)菌刺激后,基因在血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、腸中的表達(dá)水平明顯上調(diào)。同時(shí),利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了重組表達(dá)；制備多克隆抗體之后,進(jìn)行細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)rFc-DWD與實(shí)驗(yàn)所選擇的革蘭氏陽(yáng)性以及陰性菌之間存在著較強(qiáng)的結(jié)合作用。并發(fā)現(xiàn)rFc-DWD能夠抑制枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌分泌的蛋白酶的活性。所以,根據(jù)表達(dá)模式的變化以及兩種體外功能的研究結(jié)果,可以推測(cè)Fc-DWD在中國(guó)明對(duì)蝦的先天免疫系統(tǒng)中具有重要作用,可能在抗菌以及抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮著免

4、疫效應(yīng)分子的功能。
　　 2.克氏原螯蝦SWD基因的表達(dá)和功能研究
　　 我們擴(kuò)增到了克氏原螯蝦具有單WAP結(jié)構(gòu)域蛋白的cDNA序列,序列全長(zhǎng)為998 bp。開(kāi)放閱讀框?yàn)?15 bp,編碼74個(gè)氨基酸殘基:一級(jí)結(jié)構(gòu)的N末端的20個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列,C末端存在一個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域中含有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基。Pc-SWD的成熟肽含有54個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)其分子量為5.97kDa,理論上的等電點(diǎn)為7.71。在轉(zhuǎn)錄水

5、平上,Pc-SWD在心臟和腸中的表達(dá)水平較高,在血細(xì)胞、肝胰腺和鰓中的表達(dá)水平較低,在胃中沒(méi)有檢測(cè)到該基因的表達(dá)。在翻譯水平上,Pc-SWD主要在心臟、肝胰腺、鰓、和腸中高表達(dá),在血細(xì)胞中的表達(dá)水平較低,同時(shí),分泌到血淋巴中的Pc-SWD的量較少。在mRANA水平利用RT-PCR的方法研究了白斑病毒刺激后的該基因的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)病毒刺激后在血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、腸中,Pc-SWD的表達(dá)水平都發(fā)生明顯上調(diào)。在蛋白質(zhì)水平利用Western B

6、lot技術(shù),研究了Pc-SWD的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)WSSV刺激后Pc-SWD在血淋巴中的分泌量逐漸增加,呈上調(diào)趨勢(shì)；在血細(xì)胞中,Pc-SWD的表達(dá)量呈現(xiàn)出了上調(diào)趨勢(shì)；而在心臟、鰓和腸中,Pc-SWD的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。通過(guò)細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)和抑制分泌型蛋白酶活性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在體外重組表達(dá)的rPc-SWD,具有結(jié)合細(xì)菌的活性以及抑制分泌型蛋白酶的活性:因此,推測(cè)Pc-SWD是克氏原螯蝦的一個(gè)免疫相關(guān)基因,可能在抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)

7、揮著重要功能。
　　 3.克氏原螯蝦Bax抑制因子1樣蛋白(BI-1)的基因克隆與表達(dá)模式研究
　　 我們擴(kuò)增到了克氏原螯蝦BI-1基因的cDNA序列,序列全長(zhǎng)為1970 bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?08 bp,編碼235個(gè)氨基酸殘基；在氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)中,N末端不具有信號(hào)肽序列,只包含一個(gè)由211個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域。成熟肽預(yù)測(cè)的分子量為25.9 kDa,理論等電點(diǎn)為9.37。從qRT-PCR的結(jié)果來(lái)看,在轉(zhuǎn)錄水平上,Pc-