Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3在人腦膠質瘤中的表達.pdf

1、膠質瘤起源于腦部神經膠質細胞，是中樞神經系統(tǒng)中最常見腫瘤，據統(tǒng)計腦膠質瘤占中樞神經系統(tǒng)原發(fā)腫瘤的40-50％。與其他部位常見腫瘤相比，膠質瘤發(fā)病率較低。然而，膠質瘤卻有著極為不成比例的發(fā)病率和死亡率，目前總體預后不佳。隨著醫(yī)學免疫學的發(fā)展，大量研究發(fā)現人體免疫系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關系。Nod樣受體(Nod-like receptor，NLR)作為一種胞內模式識別受體，具有識別入侵病原體和激活先天免疫反應的重要功能，是一類細胞內感

2、應分子。NLRP3作為NLR家族成員之一，在多種疾病的防御和發(fā)生過程中具有重要作用。NLRP3可以調節(jié)IL-1β和IL-18的成熟與分泌，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。IL-1β和IL-18這兩個緊密相關的IL-1家族細胞因子對宿主免疫反應起著關鍵調控因子的作用，同時在人腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前NLRP3在膠質瘤中的表達以及對于預后的指導意義報道較少。
　　 研究目的:
　　 1.研究Nod樣受體熱

3、蛋白結構域相關蛋白3(Nod-like receptor pyrindomain-containing protein 3，NLRP3)在人腦膠質瘤組織中的表達。
　　 2.探討NLRP3在人腦膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。為治療膠質瘤尋找新的靶點提供理論依據。
　　 研究對象及方法:
　　 1.研究對象
　　 按照2007年WHO中樞神經系統(tǒng)腫瘤分類及分級標準，將所收集的49例人腦膠質瘤組織根據其病理類型

4、分為低級別組（20例）和高級別組（29例），并收集腦外傷后行顱內減壓手術切除的正常腦組織10例做對照。
　　 2.研究方法
　　 2.1、免疫組織化學(Immunohistochemistry)法檢測NLRP3表達量及組織定位蠟塊包埋組織，3μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟2次，5～10min/次，梯度酒精水化，EDTA抗原修復液(pH9.0)高壓修復2min，待組織切片自然冷卻后PBS洗1次。滴加濃度為1∶100的單克隆抗體N

5、LRP3（Ⅰ抗），4℃孵育過夜。PBST洗3次，5min/次，滴加羊抗鼠的Ⅱ抗，37℃孵育45 min，PBST洗3次，5min/次。DAB(1∶50)顯色，蘇木素復染30sec，中性樹膠封片。正常腦組織切片作為對照。
　　 2.2、免疫印跡(western blot)法檢測NLRP3在蛋白水平表達
　　 從-80℃冰箱中取出正常及膠質瘤組織加入裂解液與蛋白酶抑制劑，研磨后超聲震碎，15000×g/min，離心10min

6、，離心半徑13.5cm，4℃，上清液轉移到新的EP管中，做標記，BCA測定，并調整蛋白濃度，蛋白樣品中加入1/6體積的蛋白上樣緩沖液，煮沸10min。加樣于配好的SDS凝膠，積層膠90V，進入分離膠后110V，切膠，轉膜，封閉用1％的BSA，室溫1.5h。一抗孵育，4℃過夜。1×TBST洗10min，重復3次，二抗(1∶5000)37℃孵育1h，1×TBST洗10min，重復3次，顯色。
　　 2.3、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈

7、反應(QRT-PCR)法檢測NLRP3在mRNA水平表達
　　 根據Invitrogen公司Total RNA提取kit說明書完成。紫外分光光度計測定各樣本的RNA濃度。按照Ferments逆轉錄試劑盒說明書，逆轉錄體系為20μL，逆轉錄每個樣本RNA1μg，引物選擇oligo(dT)1μL，5×Reactin Buffer4μL，10MmdNTP Mix2μL,RibolockTM Rnase Inhibitor1μL,Rev

8、ertAiTMM-MuLV Reverse Transcriptase1μL，RNase-free water(0～11μL).反應條件:65℃孵育5min，42℃，60min，70℃5min.QRT-PCR檢測目的基因及內參:反應體系為25μL∶(2x)SYBR Green qPCR master mix 12.5μL,Template cDNA 2μL,Forward Primer 1μL,ReversePrimer 1μL，nuc

9、lease-free Water 8.5μL.反應條件:預變性95℃5min，55℃退火1min，68℃延伸30s，40個循環(huán)。
　　 研究結果:
　　 NLRP3在正常腦組織中表達不明顯，在低級別膠質瘤中表達較少，在高級別膠質瘤中表達明顯，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。人腦膠質瘤組織中NLRP3在mRNA水平及蛋白水平均高于正常腦組織(P＜0.01)。NLRP3的表達與人腦膠質瘤的惡性程度呈正相關。

10、　　 結論:
　　 1、人腦膠質瘤中存在NLRP3的異常表達，其表達量隨膠質瘤惡性程度的升高而增加。
　　 2、NLRP3在人膠質瘤的發(fā)生和侵襲中可能發(fā)揮著重要的作用。
　　 3、檢測NLRP3的表達有助于膠質瘤分化程度的判斷。
　　 創(chuàng)新點及意義:
　　 1、本研究首次檢測了NLRP3在人腦膠質瘤組織中的表達情況，發(fā)現其隨著腫瘤病理級別的升高而增加。據此預測其可能在膠質瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮