小梅山豬Ghrelin基因的克隆及其在生殖軸中的表達(dá).pdf

1、生長(zhǎng)激素釋放肽(Ghrelin)是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHS-R)的一種內(nèi)源性配體，1999年從小鼠和人的胃組織中成功分離并鑒定。Ghrelin對(duì)于下丘腦-垂體-性腺的內(nèi)分泌和旁分泌效應(yīng)為新近的研究熱點(diǎn)。本試驗(yàn)以小梅山豬為實(shí)驗(yàn)材料，研究Ghrelin在小梅山豬生殖軸的表達(dá)情況，旨在探究Ghrelin對(duì)動(dòng)物繁殖性能的影響，從而為豐富動(dòng)物生殖機(jī)理和早熟品種選種選育提供理論依據(jù)。
　　 根據(jù)NCBI上已發(fā)表的野豬Ghrelin mR

2、NA序列，在跨外顯子序列處設(shè)計(jì)一對(duì)引物。采集小梅山豬胃底腺組織，利用Trizol法提取總RNA，然后用RT-PCR法進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度為341bp的目的片段。運(yùn)用TA克隆法，將目的片段連接到pMD19-T載體上，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，目的片段長(zhǎng)度為341bp，其編碼的氨基酸與人Ghrelin氨基酸有3個(gè)氨基酸不同，同源性為89.3％；與沙鼠、小鼠、大鼠、犬也有3個(gè)氨基酸不同，同源性均

3、為89.3％；與牛、綿羊有6個(gè)氨基酸不同，同源性為78.6％；與雞有13個(gè)氨基酸不同，同源性為53.6％。這為分離、克隆小梅山豬Ghrelin基因全序列提供了可能。
　　 采集初生、初情期以及性成熟公小梅山豬垂體、下丘腦、睪丸、附睪和母小梅山豬垂體、下丘腦、卵巢、子宮組織，利用Trizol法提取總RNA。RT-PCR法對(duì)其進(jìn)行組織表達(dá)譜研究，發(fā)現(xiàn)在上述組織中均有Ghrelin mRNA的表達(dá)，表明Ghrelin mRNA的表達(dá)在

4、小梅山豬上不具有組織特異性。
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定母小梅山豬生殖軸各組織中Ghrelin mRNA相對(duì)表達(dá)豐度變化。結(jié)果表明：根據(jù)性成熟生殖軸不同組織Ghrelin mRNA表達(dá)量分析，以性成熟小梅山豬卵巢Ghrelin mRNA表達(dá)量為校正樣本，表達(dá)量為1，下丘腦相對(duì)表達(dá)量為0.449，垂體相對(duì)表達(dá)量為0.316，與卵巢差異顯著(P＜0.05)，垂體與下丘腦之間差異不顯著(P＞0.05)；根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育不同階段Gh