水稻瘤矮病毒P3蛋白自身及P2蛋白與水稻PC1和PC3蛋白間的互作.pdf

1、由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)引起的水稻瘤矮病分布于東南亞和東亞稻區(qū)，并局部流行，具有一定的經(jīng)濟(jì)重要性。本文利用酵母雙雜交系統(tǒng)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)進(jìn)行水稻瘤矮病毒的蛋白自身互作及其與水稻蛋白互作的研究。
　　 首先構(gòu)建了P2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的酵母表達(dá)載體并進(jìn)行自激活效應(yīng)檢測(cè)；以水稻瘤矮病毒總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得RGDVP2、P3、

2、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的基因序列，分別連接到酵母表達(dá)載體pGADT7和pGBKT7，構(gòu)建陽(yáng)性重組子pGAD-S2、pGAD-S3、pGAD-S7、pGAD-S8、pGAD-S9、pGAD-S11、pGAD-S12以及pGBK-S2、pGBK-S3、pGBK-S7、pGBK-S8、pGBK-S9、pGBK-S10、pGBK-S11、pGBK-S12。分別將陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化酵母AH109，并涂布于不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇

3、培養(yǎng)基平板，檢測(cè)RGDVP2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12蛋白是否具有自激活活性。結(jié)果表明，各重組陽(yáng)性質(zhì)粒均不具有自激活活性，而RGDVPn10蛋白在酵母細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　 其次，利用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行RGDVP3蛋白自身互作的研究。將陽(yáng)性重組子pGAD-S3和pGBK-S3共轉(zhuǎn)化酵母AH109，并涂布于不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基平板，檢測(cè)RGDVP3蛋白自身互作的情況。結(jié)果表明，RGDVP

4、3蛋白自身存在互作。用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)在植物細(xì)胞內(nèi)自然生理?xiàng)l件下對(duì)RGDVP3蛋白自身互作的情況做進(jìn)一步驗(yàn)證。以陽(yáng)性的酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAD-S3為模板擴(kuò)增，獲得S3基因，構(gòu)建成重組雙分子熒光互補(bǔ)表達(dá)載體pSPYCE-HA-S3和pSPYNE-Myc-S3。然后將帶有HA標(biāo)簽的pSPYCE-HA-S3和帶有c-Myc標(biāo)簽的pSPYNE-Myc-S3的重組雙分子熒光表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV1301后，處理農(nóng)桿菌后混合注射煙草。切取注射部

5、位的煙草葉片組織于玻片上，在激光共聚焦顯微鏡(LeicaTCS STED, Germany)下觀察煙草表皮細(xì)胞中黃色熒光表達(dá)情況并拍照保存。雙分子熒光互補(bǔ)檢測(cè)的結(jié)果與酵母雙雜交的試驗(yàn)結(jié)果一致：RGDVP3蛋白自身存在互作。
　　 再者，利用酵母雙雜交互補(bǔ)技術(shù)，以RGDVP2蛋白為誘餌篩選水稻cDNA文庫(kù)。將誘餌質(zhì)粒RGDV pGBK-S2和水稻cDNA文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母AH109中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基，從而

6、篩選可能與誘餌蛋白P2互作的陽(yáng)性克隆菌落。利用PCR鑒定陽(yáng)性克隆中cDNA插入的片段大小，分別將含有不同大小插入片段的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)序列測(cè)定和B1ast比對(duì)，找到相關(guān)同源序列。根據(jù)同源序列相應(yīng)的注釋信息，分析所篩選到的陽(yáng)性克隆中所插入的基因片段大小、基因序列完整性以及讀碼框正確性等。結(jié)果表明，以RGDVP2蛋白為誘餌篩選水稻cDNA文庫(kù)最終獲得了2種陽(yáng)性克隆，即為水稻PC1、PC3蛋白。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)的同源基因的注釋

7、，并結(jié)合文獻(xiàn)資料對(duì)互作蛋白的研究，初步推測(cè)蛋白互作在RGDV病毒侵染、致病和寄主應(yīng)答過(guò)程中可能產(chǎn)生的作用。
　　 最后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證RGDVP2蛋白與水稻PC1、PC3蛋白之間的相互作用，提取水稻葉片總RNA后，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增分別獲得水稻PC1、PC3全長(zhǎng)ORF基因序列，將其分別連接酵母表達(dá)載體pGADT7，構(gòu)建陽(yáng)性重組子pGAD-PC1和pGAD-PC3。將誘餌質(zhì)粒pGBK-S2分別與重組子pGAD-PCI和pGAD-

8、PC3共轉(zhuǎn)化酵母AH109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基，檢測(cè)RGDVP2蛋白與水稻PC1、PC3蛋白之間的互作情況。結(jié)果表明，水稻PC1和PC3蛋白均能與RGDVP2蛋白發(fā)生互作。用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)在植物細(xì)胞內(nèi)自然生理?xiàng)l件下對(duì)RGDVP2蛋白與水稻PC1、PC3蛋白之間的互作的情況做進(jìn)一步驗(yàn)證。分別以陽(yáng)性的酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBK-S2、pGAD-PC1和pGAD-PC3為模板擴(kuò)增，獲得S2、PC1和PC3基因，構(gòu)建成重組雙分

9、子熒光表達(dá)載體pSPYCE-HA-P2、pSPYNE-Myc-PCI和pSPYNE-Myc-PC3。然后將三個(gè)重組雙分子熒光表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV1301后，處理農(nóng)桿菌后以pSPYCE-HA-P2+pSPYNE-Myc-PCI和pSPYCE-HA-P2+pSPYNE-Myc-PC3組合注射煙草。切取注射部位的煙草葉片組織于玻片上，在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS STED, Germany)下觀察煙草表皮細(xì)胞中黃色熒光表達(dá)情況

10、并拍照保存。結(jié)果表明，水稻PC3蛋白能與RGDVP2蛋白發(fā)生互作，跟酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果一致；而水稻PC1蛋白不能與RGDVP2蛋白發(fā)生互作，跟酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果不一致。
　　 綜上，本文構(gòu)建了RGDVP2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的酵母雙雜交載體并進(jìn)行自激活效應(yīng)檢測(cè)；通過(guò)酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)研究RGDVP3蛋白自身互作情況；利用酵母雙雜交互補(bǔ)技術(shù)，以RGDVP2蛋白為誘餌篩選水稻cDNA文