柔嫩艾美耳球蟲菱形蛋白樣蛋白酶(EtROMs)基因的克隆不及不同發(fā)育階段轉錄水平研究.pdf

1、菱形蛋白樣蛋白酶(Raomboid-like Proteases,ROMs)是一類在真核和大多數(shù)原核生物中高度保守的跨膜絲氨酸蛋白酶。該酶為罕見的多起源酶,能夠在接近胞膜跨膜區(qū)或膜內(nèi)將蛋白水解為多肽釋放,而催化活性的發(fā)揮依賴于鑲嵌在膜表面以下的親水催化中心。研究結果表明ROMs功能涉及不同物種的多個方面,如細胞內(nèi)生長因子的信號傳遞過程、細菌的群體敏感性產(chǎn)生、真核生物線粒體膜的融合、正常細胞的凋亡、頂復門原蟲宿主入侵及真核生物干細胞分化等

2、。目前,ROMs在頂復門原蟲中的大部分功能還沒有鑒定出來,但是ROMs在蟲體入侵宿主過程中加工、成熟微線蛋白、頂膜抗原等細胞表面粘附分子。輔助蟲體入侵直至納蟲空泡膜形成的作用已被證實。
　　 本研究利用生物信息學和比較基因組學技術注釋拼接獲得柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的三種ROMs基因序列,包括EtROM1、EtROM全長ORF序列和EtROM4部分序列。根據(jù)預測序列設計特異性引物,以E.tenella(廣

3、東株)子孢子總RNA為模板。用RT-PCR的方法成功擴增出EtRoM1、EtROM3和EtROM4的ORF序列。測序結果表明EtROM1 ORF序列全長864 bp,編碼287 aa:EtROM3 ORF序列全長774 bp,編碼257 aa； EtROM4全長ORF序列為1677 bp,編碼558 aa。然后對擴增得到的EtROM1、EtROM3和EtROM4進行生物信息學分析,結果表明三者均存在完整的Raomboid Superfa

4、mily保守結構域和作為ROMs蛋白酶家族成員特異性的7個跨膜區(qū)結構.與其它頂復門原蟲ROMs蛋白質(zhì)序列的相似性在21％-60％之間。
　　 利用實時熒光定量PCR(real-time PCR)方法對EtROM1,EtROM3和EtROM4基因在柔嫩艾美爾球蟲不同發(fā)育階段的轉錄水平進行檢測。提取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子四個時期的總RNA,將其反轉錄為cDNA后做模板,以Etact

5、in為參照基因,對EtROM1、EtROM3和EtROM4三個基因進行real-time PCR擴增,結果顯示三個基因均在子孢子階段轉錄水平最高,未孢子化卵囊階段最低,表明他們均在子孢子階段大量分泌,提示其功能與子孢子宿主細胞入侵過程有關。其中,EtROM1和EtROM4兩個基因的轉錄水平總體趨勢一致,子孢子階段達到頂峰且分別為裂殖子時期的20.11和20.58倍,未孢子化卵囊階段最低,孢子化卵囊與裂殖子期大致相同,說明了它們主要在子孢