甲殼動物血藍蛋白免疫學活性及其作用機制研究.pdf

1、目前我國是世界上最大的甲殼動物(蝦蟹)集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)國。然而,與國際蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)相比,我國商業(yè)化的蝦蟹養(yǎng)殖整體效益較低,可持續(xù)發(fā)展前景不容樂觀。究其原因,主要與蝦蟹病害和生物安全等有關。為此,學者們認為選育優(yōu)質、抗逆優(yōu)良蝦蟹品種,建立安全、生態(tài)、環(huán)保的健康養(yǎng)殖模式,是解決目前蝦蟹養(yǎng)殖疾病,提高蝦蟹品質的有效途徑。要成功解決這些問題,關鍵環(huán)節(jié)之一就是揭示蝦蟹自身免疫防御機制,尋找蝦蟹病害防治的有效方法。近年來研究表明,存在于對蝦等無脊椎動物

2、血淋巴中的血藍蛋白是一種具有抗病毒和抗細菌等多種免疫活性的多功能蛋白。本研究以凡納濱對蝦、鋸緣青蟹血藍蛋白為研究對象,在國內(nèi)外所獲研究結果的基礎之上,進一步對其免疫學活性及作用機理等進行了深入的研究,所獲研究結果具體如下:
　　1、發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍蛋白抑菌活性與其糖基化修飾有關,且OmpC為其抑菌作用靶標之一
　　首先,在本課題組已分離得到的2種糖含量和抑菌活性存在顯著差異的凡納濱對蝦血藍蛋白(LHt和LH75)的基礎之上

3、,本研究采用凝集素印跡、Tricine-SDS-PAGE和HPLC等技術,進一步發(fā)現(xiàn)LH75、LHt糖基化修飾存在顯著性差異,其中前者α-D-甘露糖、α-D-葡萄糖修飾程度比后者高;前者胰酶水解肽段分子量明顯高于后者;前者胰酶酶解HPLC圖譜表現(xiàn)為10個峰,而后者為24個峰。同時,2-DE顯示,LHt主要蛋白點為7個,大小亞基分別為3和4個點,LH75主要蛋白點為6個,大小亞基分別為4和2個點。由此說明該2種血藍蛋白不僅在蛋白質水平存在

4、差異,其糖基化修飾也存在差異。
　　繼而,選用副溶血弧菌人工感染對蝦,發(fā)現(xiàn)對蝦刺激后蝦血清中LHt、LH75表達均呈上升趨勢,且LH75上升幅度明顯高于LHt。結合前期研究發(fā)現(xiàn)LH75抑菌活性顯著高于LHt抑菌活性的研究結果,提示LH75可能是血藍蛋白發(fā)揮抑菌作用的重要組分,其抑菌活性應該與糖基化修飾有關。
　　最后,利用親和孵育獲得3種與LH75相結合的副溶血弧菌外膜蛋白(Omp),p1、p2和p3,經(jīng)質譜鑒定p2為Omp

5、C,根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)LH75對外膜蛋白敲除菌△OmpC的抑菌活性明顯降低的結果,推測OmpC應為為LH75抑菌作用靶標之一,至于其是否還存在其他作用靶標還有待于進一步研究和證實。
　　2、發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍蛋白具有凝集活性,凝集作用靶標為OmpA和OmpX
　　首先,采用親和蛋白質組學策略,發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍蛋白由分子量分別為70、72、75、76、80kDa的5個亞基組成,其與岸蟹(Carcinusaestuarii)、藍蟹(

6、Callinectessapidus)和黃道蟹(Cancermagister)血藍蛋白亞基具有高度的同源性,且3個主要亞基(p75、p76和p80)與兔抗蝦血藍蛋白抗血清呈顯著陽性,說明所獲得的青蟹血藍蛋白成分單一、可靠,適合于進一步研究。
　　繼而,采用凝集實驗和凝集抑制實驗,發(fā)現(xiàn)青蟹血藍蛋白對副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌K12和金黃色葡萄球菌等7種細菌具有凝集活性,且其凝集活性能被葡萄糖、

7、半乳糖、木糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸部分或完全抑制。說明青蟹血藍蛋白確實具有凝集活性。
　　最后,運用SDS-PAGE、Western-blotting、凝集抑制實驗、基因敲除凝集實驗等發(fā)現(xiàn)青蟹血藍蛋白凝集活性作用亞基為76kDa亞基;大腸桿菌Omp能夠抑制血藍蛋白對7種細菌的凝集活性;與大腸桿菌K12野生菌株相比,血藍蛋白對△OmpA和Omp△X凝集活性明顯降低。由此推測,青蟹血藍蛋白可能主要依賴其76kDa亞基,通過與病原菌OmpA

8、和OmpX相結合而發(fā)揮凝集活性。3、發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍蛋白具有溶血活性,溶血作用機制為膠體滲漏機制
　　采用溶血實驗發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍蛋白對雞、鼠、兔、人等多種紅細胞表現(xiàn)出依賴于鈣離子的溶血活性。其溶血活性具有“劑量-效應”效應,同時對pH、溫度敏感,在pH5-8范圍內(nèi),溶血活性隨pH上升而降低;隨著溫度的升高,溶血活性逐漸增強,37℃時溶血活性達到100％。
　　在上述研究的基礎之上,進一步采用SDS-PAGE、Western

9、-blotting、滲透保護實驗等,發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍蛋白5個亞基均可與紅細胞膜相結合,且青蟹溶血活性隨著滲透保護劑分子的增大而降低。由此推測,青蟹血藍蛋白可能依賴其全部亞基通過膠體滲漏機制而發(fā)揮溶血活性。
　　綜上所述,本課題研究主要發(fā)現(xiàn):甲殼動物(蝦、蟹)血藍蛋白具有凝集活性、抑菌活性和溶血活性,其中凝集、抑菌活性作用靶標為細菌外膜蛋白,溶血作用機制為膠體滲漏機制。所獲研究結果為揭示血藍蛋白的免疫學分子作用機制,闡明血藍蛋白與病