凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白免疫學(xué)活性及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、對蝦養(yǎng)殖是世界各地尤其是熱帶地區(qū)發(fā)展中國家的重要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)。隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,傳染性疾病特別是細(xì)菌性病和病毒性病給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。因此,深入研究對蝦抗病機(jī)制,大力推進(jìn)蝦類免疫學(xué)研究是最終戰(zhàn)勝蝦類病害的重要基礎(chǔ)。近年來研究表明,存在于蝦血淋巴中的血藍(lán)蛋白是一種具有抗病毒和抗細(xì)菌等多種免疫活性的多功能蛋白。本研究以凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白為研究對象,在國內(nèi)外所獲研究結(jié)果的基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步對其免疫學(xué)活性及作用機(jī)理進(jìn)行研究,為豐富蝦類免疫

2、系統(tǒng)研究,探索對蝦疾病免疫學(xué)防治奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用2種不同抗體親和純化所得2種血藍(lán)蛋白:LHt(抗體為兔抗血藍(lán)蛋白全蛋白)和LH75(抗體為兔抗血藍(lán)蛋白75 kDa亞基)。其均由75 kDa和77 kDa2個(gè)亞基組成;糖含量分別為1.5％和3%,通過凝集素印跡檢測到血藍(lán)蛋白含α-D甘露糖/α-D葡萄糖、α-D-N-乙酰半乳糖胺、α-L-海藻糖和β-D-半乳糖(1-3)-D-乙酰半乳糖胺四種糖基,其中,LH75中α-D

3、甘露糖/α-D葡萄糖含量為LHt的1.2倍,α-D-N-乙酰半乳糖胺含量為后者的1.5倍,說明血藍(lán)蛋白在糖基化修飾水平存在多樣性。
　　對兩種血藍(lán)蛋白進(jìn)行細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LH75凝集活性明顯高于LHt,前者為后者的4倍。凝集抑制實(shí)驗(yàn)表明,細(xì)菌外膜蛋白可以抑制血藍(lán)蛋白對大腸桿菌K12、副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌等7種細(xì)菌的凝集活性。血藍(lán)蛋白對大腸桿菌外膜蛋白敲除菌凝集結(jié)果顯示,血藍(lán)蛋白

4、對△OmpX的凝集特異性明顯降低,推測OmpX為血藍(lán)蛋白與病原菌的凝集作用靶標(biāo)。
　　體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明,血藍(lán)蛋白對大腸桿菌K12和副溶血弧菌、溶藻酸弧菌等8種蝦類致病菌均有抑制作用,但LHt和LH75抑菌效果存在顯著性差異。通過血藍(lán)蛋白對大腸桿菌 K12外膜蛋白敲除菌抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與大腸桿菌 K12野生菌株相比,血藍(lán)蛋白對△OmpC、△OmpW、△OmpFDL和△OmpTSX抑菌活性明顯降低,推測OmpC、OmpW、OmpFDL和

5、OmpTSX可能為血藍(lán)蛋白與病原菌的抑菌作用靶標(biāo)。
　　溶血實(shí)驗(yàn)顯示,血藍(lán)蛋白對多種動物紅細(xì)胞表現(xiàn)出依賴于Ca2+的溶血活性,且LH75溶血活性明顯高于LHt。血藍(lán)蛋白溶血活性pH6.0時(shí)最高,在pH6~10,溶血活性隨pH值升高而降低。血藍(lán)蛋白濃度與溶血活性表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)正相關(guān),表明血藍(lán)蛋白分子協(xié)同作用引起溶血。滲透保護(hù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著加入的滲透保護(hù)劑分子的增大,溶血活性降低,表明血藍(lán)蛋白溶血機(jī)制可能為膠體滲漏機(jī)制。通過對血藍(lán)蛋白

6、處理后的紅細(xì)胞膜進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),血藍(lán)蛋白以聚合物形式緊密結(jié)合到紅細(xì)胞膜上。由此可以認(rèn)為,血藍(lán)蛋白的溶血機(jī)制可能為:血藍(lán)蛋白以聚合體的形式緊密結(jié)合到紅細(xì)胞膜上形成離子滲透孔,引起膠體滲漏導(dǎo)致溶血。至于血藍(lán)蛋白分子與紅細(xì)胞膜作用靶標(biāo)還需進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　綜上所述,本課題研究主要發(fā)現(xiàn):①凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白具有凝集、抑菌和溶血活性;②血藍(lán)蛋白具有糖基修飾多樣性,其糖含量高低與其免疫學(xué)活性呈正相關(guān);③血藍(lán)蛋白與病