柔嫩艾美耳球蟲AMA1作用蛋白的篩選及EtMIC2和Et0440基因功能的初步研究.pdf

1、球蟲病是集約化家禽養(yǎng)殖業(yè)最為高發(fā)、風(fēng)險(xiǎn)嚴(yán)重且防治工作艱巨的疾病之一，全世界每年因球蟲病造成的虧損和防治費(fèi)用高達(dá)20億英鎊。當(dāng)前，控制球蟲病的主要方式是使用抗球蟲藥物和活疫苗，但球蟲耐藥性的產(chǎn)生、藥物殘留和活疫苗潛在散毒等問題的產(chǎn)生，推動(dòng)我們迫切地尋求新的防治途徑來控制球蟲病。子孢子是球蟲從體外侵入宿主細(xì)胞發(fā)生感染的第一個(gè)階段。阻斷子孢子侵入宿主細(xì)胞，是防治球蟲病的一種行之有效的方式。頂膜抗原1(AMA1)是頂復(fù)器門原蟲中一種高度保守的微

2、線蛋白，在瘧原蟲、弓形蟲等裂殖子/速殖子入侵宿主過程中，AMA1能與多個(gè)棒狀體頸部蛋白(RON2/4/5/8)相互作用，形成復(fù)合物，在蟲體侵入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要的功能。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲AMA1(Eimeria tenella AMA1，EtAMA1)在子孢子中蛋白表達(dá)水平要明顯高于未孢子化卵囊、孢子化卵囊和裂殖子階段，其抗體能明顯抑制子孢子入侵，表明EtAMA1是子孢子入侵宿主的關(guān)鍵蛋白，但機(jī)制尚不清楚。本研究旨

3、在利用GST pull-down聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，篩選出與EtAMA1發(fā)生相互作用的子孢子蛋白，并對其中的兩個(gè)潛在作用蛋白的特性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果為闡明球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　1.柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原-1潛在子孢子互作蛋白的篩選
　　為了篩選與柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原-1(EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白，對已構(gòu)建好的原核表達(dá)質(zhì)pGEX-6P-1-EtAMA1進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)與純化，純化的重組蛋白E

4、tAMA1-GST經(jīng)Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示在約72 kDa處有單一的目的條帶，證實(shí)了所獲得的蛋白為EtAMA1-GST融合蛋白。將EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分別與谷胱甘肽瓊脂糖珠孵育后，再分別與子孢子裂解物共孵育，洗脫液經(jīng)SDS-PAGE分析后，結(jié)果顯示三者之間的條帶明顯不同，將差異條帶切下進(jìn)行質(zhì)譜分析，對獲得的蛋白質(zhì)肽段與Uniprot中雞球蟲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對，初步獲得了10個(gè)與EtAM

5、A1存在潛在互作的柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白，包括微線體蛋白、糖酵解酶類、肌動(dòng)蛋白相關(guān)因子以及一些保守蛋白等，廣泛參與了蟲體的入侵、發(fā)育、能量代謝等生物學(xué)過程。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明EtAMA1在球蟲入侵宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　2.柔嫩艾美耳球蟲0440和MIC2蛋白與AMA1蛋白互作關(guān)系的驗(yàn)證
　　從獲得的10個(gè)與EtAMA1潛在互作的子孢子蛋白中，選取柔嫩艾美耳球蟲微線體蛋白2(Microneme p

6、rotein2，EtMIC2)和假想蛋白0440(Et0440)進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得EtMIC2和Et0440基因的開放閱讀框，其中，EtMIC2基因的部分ORF為1029bp，編碼342個(gè)氨基酸，編碼蛋白理論分子量為38kDa; Et0440基因的開放閱讀框大小為423bp，編碼140個(gè)氨基酸，編碼蛋白理論分子量為15.5kDa。構(gòu)建pcDNA3.1(+)-flag-Et0440、

7、pcDNA3.1(+)-flag-EtMIC2、pBiFC-VN155-Et0440和pBiFC-VN155-EtMIC2真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞，經(jīng)Western Blot和間接免疫熒光鑒定真核質(zhì)粒均表達(dá)后，通過免疫共沉淀(Co-IP)和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)技術(shù)對蛋白是否與EtAMA1存在相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。 Co-IP結(jié)果顯示，兩實(shí)驗(yàn)組均無蛋白復(fù)合物的形成，只出現(xiàn)EtAMA1的特異性條帶，說明EN440與EtAMA

8、1、EtMIC2與EtAMA1不存在相互作用。BiFC結(jié)果顯示，陽性對照組產(chǎn)生綠色熒光，而陰性對照組， pBiFC-VN155-Et0440和pBiFC-VC155-EtAMA，pBiFC-VN155-EtMIC2和pBiFC-VC155-EtAMA1無綠色熒光，說明Et0440與EtAMA1、EtMIC2與EtAMA1不存在相互作用。
　　3.柔嫩艾美耳球蟲Et0440和EtMIC2基因的原核表達(dá)及其功能的初步研究
　　將

9、Et0440和EtMIC2基因片段分別連接到原核表達(dá)載體pET32a和pET30a上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，在37℃條件下加入IPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白His-Et0440和His-EtMIC2。將重組蛋白純化后免疫新西蘭大白兔制備多抗血清，Western blot結(jié)果顯示Et0440和EtMIC2均具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。利用間接免疫熒光技術(shù)結(jié)果顯示， Et0440主要分布于經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基孵育后子孢子的前端和第二代裂殖子的頂

10、端，第一代裂殖子的兩端;而EtMIC2主要分布在子孢子和第二代裂殖子的前端，第一代裂殖子的兩端。純化重組蛋白His-Et0440和His-EtMIC2制備的多抗進(jìn)行體外抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示與兔IgG處理子孢子對照組相比，anti-Et0440在濃度為400μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到40％以上，可以明顯的抑制蟲體入侵細(xì)胞;與兔IgG處理子孢子對照組相比，anti-EtMIC2在濃度為400μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到20％，存在抑制作用，但是與E

11、t0440相比要低，因此初步推測Et0440和EtMIC2可能與蟲體入侵宿主細(xì)胞相關(guān)。
　　4.柔嫩艾美耳球蟲Et0440和EtMIC2真核表達(dá)質(zhì)粒免疫保護(hù)效能評價(jià)
　　7日齡雛雞進(jìn)行稱重隨機(jī)分為八組，使各組的平均初重基本相同。分別肌肉注射100μg/羽和200μg/羽的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-flag-Et0440、pcDNA3.1(+)-flag-EtMIC2及空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-flag，同時(shí)

12、設(shè)置感染對照組和健康對照組，一免七天后進(jìn)行二免，在二免七日后經(jīng)口服接種1萬/羽柔嫩艾美耳球蟲上海株孢子化卵囊，通過對體重、盲腸病變記分、卵囊排出量等指標(biāo)檢測的檢測來評價(jià)免疫效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫期間，實(shí)驗(yàn)組、感染對照組和健康對照組增重差異不顯著(P＞0.05)。在攻蟲后9天，免疫組增重普遍高于感染對照組增重，其中pcDNA3.1-flag-0440(200μg/羽)組增重明顯高于感染對照組(P＜0.05)，說明柔嫩艾美耳球蟲對雞的生長

13、發(fā)育具有明顯的抑制作用，而重組質(zhì)粒對于抵抗球蟲感染具有一定的作用;各實(shí)驗(yàn)組卵囊減少率均在65％以上，明顯高于感染對照組和空載體對照組。同時(shí)我們檢測了細(xì)胞因子的水平，結(jié)果顯示，二免后7天實(shí)驗(yàn)組IFN-γ和攻蟲后實(shí)驗(yàn)組IL-17均明顯高于對照組(P＜0.05)，而免疫后和攻蟲后TGF-β的變化均不顯著(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-flag-Et0440和pcDNA3.1(+)-flag-EtMIC2對感染柔