水牛乳腺基因表達(dá)譜與生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)基因水牛的初步研究.pdf

1、水牛是中國(guó)南方極具開(kāi)發(fā)潛力的主要家畜，具有耐粗飼、乳品品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)。但由于我國(guó)本地水牛產(chǎn)奶性能低下，致使奶水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展緩慢。因此，如何應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)培育出高產(chǎn)奶量的水牛新品種是目前要解決的主要問(wèn)題。本研究首先分析了水牛泌乳期和非泌乳期乳腺組織基因表達(dá)譜，尋找差異表達(dá)基因，研究水牛的泌乳機(jī)制，并為培育高產(chǎn)奶量的轉(zhuǎn)基因水牛提供豐富的候選基因素材;然后，探索轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在水牛轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用，以期提高水牛轉(zhuǎn)基因的效率;構(gòu)建了乳腺特異性生長(zhǎng)激素

2、基因(GH)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，在乳腺細(xì)胞和乳腺組織中進(jìn)行檢測(cè)，分析外源GH基因的表達(dá)對(duì)乳蛋白等基因表達(dá)的影響;最后，采用隨機(jī)整合、轉(zhuǎn)座子主動(dòng)整合等轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組GH基因?qū)胨；蚪M，生產(chǎn)GH轉(zhuǎn)基因的水牛胚胎，以期培育出高產(chǎn)奶量轉(zhuǎn)基因水牛新品種。本研究取得的主要結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1.水牛泌乳期與非泌乳期基因表達(dá)譜及差異表達(dá)分析。構(gòu)建水牛泌乳期和非泌乳期乳腺組織基因表達(dá)譜，分析差異表達(dá)和泌乳期高豐度表達(dá)的基因，探討水牛泌乳的分

3、子機(jī)制，也為轉(zhuǎn)基因水牛提供外源基因乳腺泌乳期特異性表達(dá)啟動(dòng)子。基因表達(dá)譜序列拼接后獲得114，014個(gè)單一的Unigenes，與牛的基因組信息比對(duì)注釋了30290個(gè)基因，可以定位到270條相應(yīng)的通路上(pathway)，其中與乳脂肪、乳蛋白和乳糖合成代謝通路相關(guān)基因表達(dá)豐度較高。在泌乳期乳腺組織中特異性表達(dá)的基因有3053個(gè)，占到所有基因序列的2.68％。比較水牛乳腺兩個(gè)時(shí)期基因表達(dá)量，泌乳期表達(dá)量上調(diào)的基因有1390個(gè)，下調(diào)的基因有5

4、851個(gè)。在270條KEGG通路中有228個(gè)通路涉及到差異表達(dá)基因，如介導(dǎo)生長(zhǎng)激素作用的JAK-STAT和MAPK信號(hào)通路。實(shí)時(shí)定量PCR(QRT-PCR)檢測(cè)到水牛的非泌乳期乳腺組織中有少量的乳蛋白基因表達(dá)。κ酪蛋白(CN3)基因表達(dá)量在非泌乳期與泌乳期乳腺中都是顯著高于其它基因。與非泌乳期相比，泌乳期乳腺CN1S1基因表達(dá)量增加了6958倍，CN1S2增加了4800倍，κCN和αLA增加了1000倍左右，而β酪蛋白增加了244倍，與

5、測(cè)序結(jié)果基本一致。泌乳期和非泌乳期的乳腺組織中檢測(cè)到GHR, PRLR和IGF1R的表達(dá)，說(shuō)明GH、PRL和IGF1可能參與了泌乳的分子調(diào)控過(guò)程。
　　 2.水牛乳腺上皮細(xì)胞(BME)基因表達(dá)分析。通過(guò)PB轉(zhuǎn)座子攜帶的LT抗原永生化誘導(dǎo)水牛乳腺上皮細(xì)胞(BME)，建立檢測(cè)乳腺轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的細(xì)胞模型。PB轉(zhuǎn)座子為骨架的永生化載體pXL-BACII-bCN2/LT轉(zhuǎn)染后的BME細(xì)胞的腺泡消失速度和成纖維樣轉(zhuǎn)變降低。在添加催乳素誘導(dǎo)

6、培養(yǎng)后，第30代的永生化處理的BME細(xì)胞能檢測(cè)到乳蛋白基因的表達(dá)。其中CN1S1基因表達(dá)量為非泌乳期乳腺的88.32倍，CN3為32.09倍，CN1S2和αLA基因表達(dá)量分別為2.8倍和3.3倍。結(jié)果表明，初步建立了細(xì)胞水平檢測(cè)乳腺特異性表達(dá)載體的體外模型。
　　 3.水牛轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法的建立。本研究通過(guò)構(gòu)建piggyBac(PB)，passport(PP)和sleeping beauty(SB)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因載體，轉(zhuǎn)染水牛

7、胎兒成纖維細(xì)胞(BFF)，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，以期建立水牛轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染水牛的胎兒成纖維細(xì)胞(BFF)后，均能觀察到標(biāo)記基因EGFP的表達(dá)。應(yīng)用p18T載體、PB、PP和SB轉(zhuǎn)座子表達(dá)NEO基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后篩選獲得的G418抗性細(xì)胞克隆形成數(shù)(CFN)差異不顯著。與隨機(jī)整合相比，加入相應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶后，PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)抗性細(xì)胞克隆數(shù)量提高了22倍，PP轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)提高了8倍，SB轉(zhuǎn)座子提高了14倍，PB轉(zhuǎn)

8、座子系統(tǒng)獲得了最高的轉(zhuǎn)基因效率。PB轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶比例(Tn∶Ts)為1∶1的時(shí)候轉(zhuǎn)基因效率最高，而PP和SB轉(zhuǎn)座子為1∶0.5。當(dāng)添加的轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒過(guò)量時(shí)，PB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因效率下降幅度沒(méi)有PP和SB轉(zhuǎn)座子大。通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)了不同轉(zhuǎn)座子外源基因的整合拷貝數(shù)，結(jié)果顯示:隨機(jī)整合組每個(gè)單倍體基因組整合拷貝數(shù)從5個(gè)拷貝至51.9個(gè)拷貝不等。PB轉(zhuǎn)座子為16.62拷貝，PP轉(zhuǎn)座子為2.5拷貝。SB轉(zhuǎn)座子整合到基因組中的轉(zhuǎn)基因拷貝

9、數(shù)最多，單倍體基因組中為98個(gè)拷貝。以上結(jié)果顯示:三種轉(zhuǎn)座子均能應(yīng)用于水牛的轉(zhuǎn)基因研究，轉(zhuǎn)基因效率優(yōu)于隨機(jī)整合轉(zhuǎn)基因。
　　 4.生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建與細(xì)胞水平檢測(cè)?？寺》治隽巳?、奶牛和水牛的生長(zhǎng)激素基因(GH)，PB轉(zhuǎn)座子攜帶的GH轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染乳腺細(xì)胞和乳腺組織塊，研究GH轉(zhuǎn)基因的表達(dá)對(duì)其乳蛋白等基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示牛、水牛和牦牛之間GH基因的同源性最高，與其它偶蹄目也有較高的同源性，生長(zhǎng)激素氨基酸序列也較為保守。將分

10、別攜帶有人和奶牛GH的piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因載體(pXL-BacII-bCN2.8/hGH2.1-EGFP-Neo，pXL-BacII-bCN2.8/hGH2.2-EGFP-Neo)轉(zhuǎn)染人的乳腺癌細(xì)胞系(Bcap37)，能觀察到EGFP的表達(dá)，RT-PCR和western blot均能檢測(cè)到人和奶牛GH基因的特異性表達(dá)。分別用p18T-bGH和PB-bGH轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染永生化BME細(xì)胞后，檢測(cè)到bGH轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。β酪蛋白、CN1

11、S1酪蛋白和α乳清白蛋白基因表達(dá)量均有顯著提高，GHR和IGF1R基因的表達(dá)量也有上調(diào)。pB-bGH載體轉(zhuǎn)染的水牛乳腺組織塊，CN1S1，CN1S2，β酪蛋白和κ酪蛋白基因的表達(dá)量提高了50倍以上，初步證明GH轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)染可以顯著提高乳蛋白基因的表達(dá)水平。
　　 5.轉(zhuǎn)GH基因水?？寺∨咛サ纳a(chǎn)與早產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆水牛的檢測(cè)。使用受精卵胞質(zhì)注射、卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)和轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)GH基因的水牛胚胎，并

12、對(duì)經(jīng)胚胎移植后的獲得的早產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆水牛進(jìn)行了鑒定。水牛受精卵胞質(zhì)注射和水牛卵母細(xì)胞內(nèi)單精子注射(ICSI) PB轉(zhuǎn)座子GH轉(zhuǎn)基因載體和轉(zhuǎn)座酶載體后，均獲得EGFP表達(dá)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性胚胎。以轉(zhuǎn)GH基因BFF為核供體，制備了EGFP表達(dá)的轉(zhuǎn)基因克隆水牛囊胚。經(jīng)胚胎移植后獲得了轉(zhuǎn)GH基因克隆水牛的妊娠，于9月齡早產(chǎn)。特定藍(lán)光照射下在早產(chǎn)水牛頭側(cè)部能觀察到綠色熒光表達(dá)，解剖結(jié)果顯示心、肺、肝、胃和脾發(fā)育正常，但大腸，腎臟，生殖系統(tǒng)等發(fā)育不良，而