重組牛生長(zhǎng)激素注射于泌乳水牛后潛在生物靶標(biāo)的研究.pdf

1、生長(zhǎng)激素(Growth hormone,GH),又稱促生長(zhǎng)素,它是由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一類單鏈肽激素,與催乳素(PRL)和胎盤催乳素(PL)同屬于1個(gè)基因家族,廣泛存在于各種脊椎動(dòng)物中。它的主要作用是刺激機(jī)體生長(zhǎng),提高組織和細(xì)胞新陳代謝。重組牛生長(zhǎng)激素(Recombinant bovine growth hormone,rbGH)如今被美國(guó)等國(guó)家廣泛用于畜牧生產(chǎn)中,將其注射奶牛,可顯著提高奶牛的產(chǎn)奶量。研究發(fā)現(xiàn),注射了rbGH的

2、奶牛會(huì)出現(xiàn)極其嚴(yán)重的乳房炎、跛行、生殖障礙等疾病,而攝入這種牛奶的人們也存在更高的致癌風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)此歐盟成員國(guó)和加拿大明令禁止使用rbGH,但是濫用rbGH以獲得暴利仍無法避免。
　　為了有效監(jiān)管rbGH的使用,建立一套檢測(cè)方法來鑒定動(dòng)物是否注射了rbGH顯得極為重要。由于rbGH和天然bGH具有極高的相似性,通過直接檢測(cè)方法區(qū)分這兩者是極其困難的。因此,開發(fā)包括生物靶標(biāo)在內(nèi)的間接分析方法則可能是檢測(cè)rbGH有效的替代方案。本研究主要

3、分為兩大部分:1)制備針對(duì)rbGH的單克隆抗體,建立檢測(cè)血清GH、血清胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)和牛奶IGF-1的雙夾心ELISA方法;2)建立檢測(cè)外周血白細(xì)胞差異表達(dá)基因靶標(biāo)的方法。
　　由于目前對(duì)水牛尚無GH研究的相關(guān)報(bào)道,本研究以水牛為模式動(dòng)物,應(yīng)用韓國(guó)LG生命科學(xué)公司的rbGH注射8頭泌乳水牛,每?jī)芍茏⑸?次,共注射5次,持續(xù)10周(每2周為一個(gè)周期,共5個(gè)周期)。血液樣品于每次rbGH注射后的第2、5、9、14天收集

4、;牛奶樣品從第1和第5周期的第2、7、14天收集;外周血白細(xì)胞樣品收集于每個(gè)注射周期的第2和第14天。
　　為了區(qū)分高度相似的rbGH和天然bGH,本研究制備了具有高度特異性和敏感性的單克隆抗體2A3和3G6,其中2A3能將高度相似的rbGH和天然bGH完全區(qū)分開。建立了三種雙夾心ELISA方法分別檢測(cè)血清GH、血清IGF-1及牛奶IGF-1的水平。并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法驗(yàn)證這三種方法的靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性,證實(shí)了方法的有效性

5、。同時(shí),它們的最低檢出值可分別達(dá)到0.089ng/ml、20ng/ml、0.025ng/ml。
　　雙夾心ELISA檢測(cè)的結(jié)果顯示:1)與對(duì)照組相比,在每次rbGH注射后的第2天,實(shí)驗(yàn)組水牛血清中GH的水平顯著的升高(p<0.001),盡管隨后就迅速下降,但是在第5天仍顯著高于對(duì)照組(p<0.001),到第9和14天才恢復(fù)到了基礎(chǔ)水平?？梢?血清GH含量能作為檢測(cè)水牛是否注射rbGH的一個(gè)良好和可靠的指標(biāo),但是血清GH含量在達(dá)到峰

6、值后迅速下降的現(xiàn)象限制了樣品檢測(cè)的時(shí)間。2)在rbGH注射后的第2天,實(shí)驗(yàn)組水牛血清中IGF-1的濃度迅速提高(p<0.001),并在第5天或第9天達(dá)到峰值。盡管在第14天,血清IGF-1的含量已有所下降,但其平均值仍顯著高于對(duì)照組(p<0.01)。表明血清IGF-1含量的檢測(cè)比起血清GH具有更長(zhǎng)的檢測(cè)周期,在rbGH注射后兩周內(nèi)采集樣品都能檢測(cè)到。而且,如果用該檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)在同一養(yǎng)殖場(chǎng)的動(dòng)物血清中都檢測(cè)出高濃度的IGF-1則是注射了r

7、bGH的重要判斷依據(jù)。3)水牛奶中IGF-1的含量在整個(gè)rbGH注射周期中都顯著增加,在第2天(p<0.001)和第7天(p<0.01)達(dá)到峰值,比對(duì)照組高出2.3倍。由于牛奶中高水平IGF-1對(duì)公共衛(wèi)生的潛在危害,因此注射rbGH后水牛奶中較高濃度的IGF-1,不單單只作為鑒定rbGH注射的指標(biāo),更是在食品安全中需要密切監(jiān)測(cè)的對(duì)象。
　　運(yùn)用基因芯片篩選到了rbGH注射水牛和對(duì)照水牛外周血白細(xì)胞中的差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)其中有110

8、個(gè)基因出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào),并從中篩選出10個(gè)差異最明顯,表達(dá)最穩(wěn)定的基因(ABCG1,DQA1,DQA5,DQB,DLC,Ferritin-like heavy chain,Integrinβ-fragment,KKCC,TKDP3,SUCLG)。隨后運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)水牛外周血白細(xì)胞中這10個(gè)通過基因芯片技術(shù)篩選出來的基因,以及15個(gè)基因的表達(dá)水平,其中包括屬于生長(zhǎng)軸的10個(gè)基因(GHR、IGF-1、IGF-2、IGFBP-1、-

9、2、-3、-4、-5、-6、IGF-1R),5個(gè)生長(zhǎng)激素受體5非翻譯區(qū)的突變體(1B、1C1、1C3、1D、1I)。結(jié)果顯示,rbGH顯著地影響著水牛外周血白細(xì)胞中一些基因的表達(dá)(IGFBP-1,p<0.001;DQA5,p<0.01;DQB p<0.05;DLC p<0.001;Ferritin-like heavy chain,p<0.05;Integrinβ-fragment,p<0.05)。其中DQA5的表達(dá)水平在注射了rbGH

10、后顯著地增加并維持在較高的水平,未注射rbGH的水牛幾乎無法檢測(cè)到DQA5的表達(dá)(其中只有一頭患乳房炎的水牛檢測(cè)到了DQA5的高表達(dá))。由此可見,DQA5也能作為鑒定rbGH注射的生物靶標(biāo),但是必須謹(jǐn)慎使用,以防假陽性的出現(xiàn)。
　　本研究通過建立免疫分析和基因靶標(biāo)檢測(cè)方法來鑒定模式動(dòng)物水牛是否注射了rbGH,并且通過潛在生物靶標(biāo)(包括血清GH、血清IGF-1、牛奶IGF-1及25個(gè)水牛外周血白細(xì)胞基因)的檢測(cè),證實(shí)了所建立方法的可