亞洲璃眼蜱功能基因的克隆、表達和免疫效果分析.pdf

1、 本研究以從本實驗室建立的亞洲璃眼蜱雌蜱未吸血和半飽(吸血5天)狀態(tài)的唾液腺基因表達差異建立的消減文庫中篩選出的兩個新基因EST片段為對象(根據(jù)基因大小分別命名為AP27、AP18)，開展這兩個基因的全長克隆、體外表達及免疫工作以分析其功能，為蜱和蜱病的控制作一些探索?！　⊙芯渴紫冗\用生物軟件分析兩個EST片段(據(jù)測序號分別命名為1-6和B12)的結(jié)構(gòu)，分析出其中一個EST片段(1-6)為一完整基因結(jié)構(gòu)，該基因開放性閱讀框含51

2、0個堿基，共編碼170個氨基酸，預測分子量為18.36Kda,故將其正式命名為AP18；另一基因片段(命名為B12)具有典型的基因3’端特征，而5’端缺失，故根據(jù)已有序列設計三條基因特異性引物：GSP1=5’-TGTACTGGAGCATGCAC-3’，GSP2=5’-GAGCACACCGGGTCAGGTCCTTG3’，GSP3=CTTCATCTCGTTGGGTGATC-3’，用于5’-RACE擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接入pGEM-T質(zhì)

3、粒載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和測序。　　其次，運用RT-PCR方法分析AP18、AP27在亞洲璃眼蜱中的分布情況，分別提取亞洲璃眼蜱雌蜱的未吸血成蜱的唾液腺和半飽血成蜱不同部位包括殼、唾液腺、腸的總RNA，取相同量的總RNA進行RT-PCR分析，結(jié)果二者在蜱的殼、腸、和吸血時的唾液腺中均有表達，而在未吸血蜱的唾液腺中不表達；且在殼中的表達豐度相較略低?！　≡俜謩e將兩個基因重組入PET28a、PET32a、PGEX-4T系統(tǒng)進行體外原