鐮形扇頭蜱抗凝血分子基因的克隆表達和產物活性分析.pdf

1、蜱是一類專性吸血的節(jié)肢動物，不僅是動物重要的外寄生蟲，還是僅次于蚊子的人和動物疾病的第二傳播媒介。與其它的吸血動物相比，蜱的吸血時間特別長，一般在10-14天才能達到飽血狀態(tài)。在蜱吸血過程中，宿主會發(fā)生微血管收縮、血小板凝集和血液凝固等凝血反應。蜱通過唾液腺分泌抗凝血分子以克服宿主的凝血反應，達到成功吸血的目的。蜱源抗凝血分子的研究，不僅有助于了解蜱的吸血及病原傳播的復雜機制，開拓蜱及蜱傳疾病新型防治技術。而且在開發(fā)人類心血管疾病的新型

2、生物制劑上具有潛在價值。 鐮形扇頭蜱是我國南方優(yōu)勢蜱種，我們以吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消減雜交cDNA文庫中的EST數據為基礎，克隆出一個抗凝血分子編碼基因C18。該基因全長580bp，編碼164個氨基酸，預測分子量為18.04kDa(包括信號肽)。該蛋白分子在5’端有一個18個氨基酸構成的信號肽序列，并含有一個典型的抗凝血Kunitz功能域。經同源性比較該基因與組織通道抑制因子同源。用RT-PCR方法分析了C18在鐮形扇頭蜱吸

3、血前后的表達情況，結果表明C18為蜱吸血后誘導表達。成功構建了重組表達載體pGEX-4T-1-C18，并轉化到表達菌BL21中，經IPTG誘導，結果表明C18可以在原核表達系統(tǒng)中高效表達，應用GST融合蛋白純化系統(tǒng)，可獲得純化的目的蛋白。通過血漿復鈣時間試驗和血漿部分凝血酶激活時間試驗對重組蛋白的抗凝血活性經行檢測，發(fā)現(xiàn)重組蛋白同時對內源性和外源性的凝血具有明顯抑制作用。 同時以鐮形扇頭蜱吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消減雜交cDNA

4、文庫中的EST數據為基礎，應用RACE方法從鐮形扇頭蜱體內克隆出另一個抗凝血基因C201的全長序列，該基因全長693bp，開放閱讀框編碼195個氨基酸，預測分子量為22.62kDa，該蛋白分子在5’端有一個20個氨基酸構成的信號肽序列，并含有一個典型的抗凝血Kunitz-BPTI功能域。經同源性比較該基因與組織通道抑制因子II基因序列高度同源。 綜上所述，本研究首次克隆了鐮形扇頭蜱C201抗凝血蛋白基因，為該基因的進一步研究打下