ADRB3基因新突變的功能及與疾病易感性的關(guān)聯(lián)研究和SLC30A8、IGF2BP2基因多態(tài)性對瑞格列奈療效的影響.pdf

1、遺傳藥理學(pharmacogenetics)是研究由遺傳變異引起的藥物反應(yīng)異常的學科,主要集中研究引起藥物反應(yīng)個體和群體差異的變異基因。藥物基因組學(pharmacogenomics)是個體遺傳差異與藥物效應(yīng)之間相互關(guān)系的學科,研究整個基因組范圍內(nèi)所有編碼與藥物代謝、體內(nèi)轉(zhuǎn)運、效應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因,其分子基礎(chǔ)是基因多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism,SNP)。
　　 遺傳藥理學研究發(fā)現(xiàn),藥物代

2、謝酶、受體和轉(zhuǎn)運體活性的改變是導(dǎo)致臨床上藥物治療中出現(xiàn)藥物反應(yīng)個體差異常見因為,藥物代謝酶、受體和轉(zhuǎn)運體基因的遺傳多態(tài)性是藥物作用個體差異的重要決定因素。許多藥物受體表現(xiàn)基因多態(tài)性并影響藥物的作用,如p受體的多態(tài)性改變β受體對激動藥的敏感性而影響這類藥在哮喘治療中的作用。受體的多態(tài)性可能從改變藥物與受體的親和力、受體的穩(wěn)定性和受體的調(diào)節(jié)、與信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的耦合或與靶基因結(jié)合變化及受體之間的相互調(diào)節(jié)等方面影響個體間藥物效應(yīng)的差異。
　

3、　 β腎上腺素受體(β-adrenoceptor,β—AR)為腎上腺素受體的一個亞家族,屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族,以腎上腺素和去甲腎上腺素為內(nèi)源性配體,通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cAMP水平,介導(dǎo)多數(shù)器官與組織的功能,是藥物作用的一個重要靶點,該類受體的表達及功能與疾病的發(fā)生發(fā)展和藥物效應(yīng)均有潛在的關(guān)系。其成員β3-AR,與β1-AR和β2-AR有不同的藥理特性,β3-AR主要表達在脂肪組織、心臟、骨骼肌、膀胱和小腸等組織中,尤其以內(nèi)臟脂肪組織如

4、腎周及網(wǎng)膜最豐富,對機體脂肪代謝的調(diào)節(jié)和能量平衡的維持有重要作用。β3-AR發(fā)揮效應(yīng)通過與Gs蛋白結(jié)合活化相應(yīng)的PKA(protein kinase A)通路和與Gi蛋白結(jié)合激活ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1 and2)通路。75-80％的脂肪酸水解效應(yīng)是由PKA介導(dǎo)的,而20-25％通過ERK1/2途徑實現(xiàn)。β3腎上腺素受體基因(ADRB3)定位于8p12-p11.2,編碼4

5、08個氨基酸。β3-AR在人群中呈多態(tài)性表達,目前已發(fā)現(xiàn)ADRB3基因上四個SNPs,T190C為唯一功能性變異,使受體蛋白第64位色氨酸由精氨酸替代(Trp64Arg)。人群中Arg64等位基因的發(fā)生頻率具有一定的種族和地區(qū)差異,印地安人為31％而美國白人為8％,該多態(tài)性可能與體重增加、胰島素抵抗、2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)的發(fā)生發(fā)展及冠心病發(fā)病等有關(guān)。ADRB3 Trp64Arg多態(tài)在T2

6、DM患者中的分布頻率高于正常對照組,在多個人群中的研究都發(fā)現(xiàn)突變型個體的體重指數(shù)顯著增高,攜帶Arg64突變等位基因的肥胖個體比Trp64攜帶者的減輕體重的能力要弱。有研究表明,Trp64Arg可能影響β3-AR在膜表面的分布及信號傳導(dǎo),從而影響其介導(dǎo)的生理和藥理效應(yīng)。
　　 我們前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)位于ADRB3基因1號外顯子mRNA上493位和769位各有一個T被C替代的堿基突變,導(dǎo)致氨基酸序列中165和257位絲氨酸突變成

7、脯氨酸,記為Ser165Pro和Ser257Pro,這兩個新突變?yōu)楸菊n題組首次發(fā)現(xiàn),已申請進入GENEBANK(編號:FJ170286和FJ170287)和SNPBANK(編號:rs72655364和rs72655365)?；贏DRB3多態(tài)性與T2DM和肥胖相關(guān)的研究背景,本課題旨在研究ADRB3基因中三個錯義突變Trp64Arg、Ser165Pro和Ser257Pro在中國漢族T2DM、肥胖和對照人群中的分布頻率及與T2DM、肥胖疾

8、病易感性的關(guān)系；并構(gòu)建ADRB3野生型和不同突變型的真核表達載體和穩(wěn)定表達細胞株,為研究人β3-AR的功能及調(diào)控機制提供實驗基礎(chǔ),同時檢測經(jīng)特異性β3-AR激動劑CL316,243刺激后細胞內(nèi)cAMP含量和ERK1/2蛋白磷酸化的水平判斷野生型和突變型受體對兩條信號傳導(dǎo)通路的影響,從可能的機制上解釋基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系。
　　 T2DM是以胰島素抵抗和胰島p細胞功能受損為特征的疾病,遺傳度變異較大,全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(

9、Genome-wide associationstudies,GWASs)和meta分析發(fā)現(xiàn)多個新的T2DM的易感位點,這些區(qū)域可能在胰島素的分泌和胰腺β細胞功能中發(fā)揮重要作用。
　　 SLC30A8(zinc transporter member8)基因編碼蛋白鋅轉(zhuǎn)運體-8(ZnT-8),位于胰島β細胞中含有胰島素顆粒的囊泡膜上,是參與胰島素合成、儲存和分泌的重要成分。多項GWASs研究發(fā)現(xiàn),SLC30A8基因rs132666

10、34多態(tài)與T2DM的發(fā)病風險增加相關(guān)。SLC30A8基因SNP rs13266634和rs16889462位于第八個外顯子,引起第325位精氨酸至色氨酸(谷氨酰胺)的錯義突變(R325W或R325Q)影響胰島素顆粒中鋅的蓄積、胰島素的穩(wěn)定、貯存和分泌。胰島素樣生長因子2(IGF2)mRNA結(jié)合蛋白2(insulin—like growth factor2 mRNA-binding protein2,IGF2BP2)屬于mRNA結(jié)合蛋白家

11、族,與RNA的定位、穩(wěn)定性及翻譯等功能有關(guān),IGF2BP2基因的變異與T2DM的進展相關(guān),且IGF2BP2同樣能夠影響胰島素的分泌。
　　 瑞格列奈是一種常用于治療T2DM的安全有效的胰島素促泌劑,瑞格列奈通過結(jié)合磺酰脲類受體,抑制胰島β細胞上的ATP敏感性鉀通道,促進鈣離子內(nèi)流而刺激胰島素的分泌。瑞格列奈主要在肝臟由CYP3A4和CYP2C8氧化代謝,由OATP1B1轉(zhuǎn)運。瑞格列奈在臨床治療T2DM過程中常出現(xiàn)較大的個體差異,

12、除了可能由于參與代謝和轉(zhuǎn)運的基因變異導(dǎo)致血藥濃度的改變而產(chǎn)生的差異外,其他參與胰島素合成、分泌和釋放過程中的基因變異也可能導(dǎo)致瑞格列奈療效的改變。本實驗旨在研究中國漢族人群SLC30A8基因rs13266634、rs16889462多態(tài)性和IGF2BP2基因rs1470579和rs4402960多態(tài)性的等位基因、基因型頻率分布特征及其與代謝相關(guān)指標的關(guān)系,了解該基因多態(tài)性與T2DM的易感相關(guān)性及對瑞格列奈療效的影響。
　　 本課

13、題的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.ADRB3基因Trp64Arg多態(tài)性與中國人T2DM的發(fā)病無明顯相關(guān)性,Ser165Pro和Ser257Pro多態(tài)性與T2DM的發(fā)病相關(guān)。
　　 2.健康對照組中,ADRB3基因Trp64Arg位點多態(tài)性與WHR和HbAlc值顯著相關(guān)。在健康對照組中Ser165Pro位點突變與年齡、TG、TC和FPG值顯著相關(guān)；在Nonobese T2DM患者中,Ser165Pro位點突變與BMI和FP

14、G值顯著相關(guān)；在ObeseT2DM患者中,Ser165Pro位點突變與LDL、HbAlc、FPG、腰圍、臀圍、DBP、總蛋白、白蛋白、PINS和HOMA-β顯著相關(guān)。在Nonobese T2DM患者中,Ser257Pro位點突變與腰圍和WHR顯著相關(guān)。
　　 3.ADRB3基因Ser165Pro和Ser257Pro基因多態(tài)性、年齡等與T2DM顯著關(guān)聯(lián),為危險因素。Ser165Pro基因多態(tài)、性別、腰圍、臀圍、WHR、TG與肥胖顯

15、著關(guān)聯(lián),為危險因素。
　　 4.成功構(gòu)建了不同基因型的人pcDNA3.1(+)/ADRB3-WT(WildType)、ADRB3-Trp64Arg、ADRB3-Ser165Pro、ADRB3-Ser257Pro和ADRB3一Com Mut真核表達載體和表達不同基因型的
　　 ADRB3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株HEK293和CHO-K1。
　　 5.表達ADRB3 Trp64Arg、Ser165Pro、Ser257Pro和C

16、om Mut基因型的細胞經(jīng)β3-AR激動劑CL316,243作用后后產(chǎn)生第二信使cAMP的能力較野生型和空載體組顯著下降,對ERK1/2蛋白的磷酸化變化不同基因型細胞株間沒有顯著差異。
　　 6.SLC30A8基因rs13266634位點的C等位基因和rs16889462位點的A等位基因可能是T2DM的風險等位基因,SLC30A8基因可能是中國漢族T2DM患者的易感基因之一,該基因的多態(tài)性影響瑞格列奈的療效,突變基因型攜帶者使用

17、瑞格列奈的效果優(yōu)于野生型攜帶者。
　　 7.中國人群中IGF2BP2rs1470579和rs4402960與T2DM的發(fā)生發(fā)展相關(guān)并影響瑞格列奈的療效。
　　 本課題從分子、細胞到臨床整體水平對β3-AR基因多態(tài)性與T2DM和肥胖的疾病易感相關(guān)性提供了遺傳藥理學的解釋,并從藥物基因組學的角度探討了瑞格列奈臨床療效的差異,為T2DM的病因研究及合理用藥的機理進行初步探索。遺傳學的研究在T2DM的病因?qū)W和進展機制的研究中具有