PCOS與SLC30A8基因多態(tài)性的關聯(lián)及雌激素對B細胞功能的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、第一部分 多囊卵巢綜合征(PCOS)與SLC30A8基因多態(tài)性位點rs13266634的關聯(lián)研究 目的：本研究通過分析比較rs13266634多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率在PCOS病例組與對照組中分布的差異，比較不同基因型的PCOS病人的內(nèi)分泌及代謝特征表型的差別，研究單核苷酸多態(tài)位點rsS13266634的不同基因型與PCOS不同臨床表型的相關性，探討SLC30A8基因在PCOS的發(fā)病及病理生理的變化過程中的相關作用，從而

2、驗證我們的假設是否正確。 研究方法： 研究對象：本研究依據(jù)2003年鹿特丹標準選擇PCOS患者894例，并選擇622名健康的非糖尿病女性作為對照。分別測定PCOS患者的激素、生化指標、OGTT，測量身高、體重、腰圍和臀圍，計算體重指數(shù)、腰臀比例及HOMA-IR指數(shù)。自肘靜脈抽取外周血，抗凝處理后，提取全血基因組DNA。 基因分型：本研究采用單管等位基因特異性PCR結合熒光溶解曲線分析的方法進行基因分型。根據(jù)方法原

3、理設計一對等位基因特異性上游引物并共用一個相同的下游引物。PCR反應結束后立即進行熒光溶解曲線分析，根據(jù)曲線類型的不同進行基因分型。PCR反應及熒光溶解曲線分析在ABI7500實時熒光PCR反應儀上進行?；蚍中屯瓿珊螅瑢⑺斜环中偷臉吮局械?％進行測序，以確定該基因分型方法的準確性。 統(tǒng)計學分析：計算病例組與對照組中rs13266634多態(tài)位點各基因型的頻率及等位基因頻率，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗使用X2檢

4、驗來計算，病例組與對照組之間基因型頻率與等位基因頻率的比較采用X2檢驗的方法。PCOS組中患者的內(nèi)分泌及代謝特征表型與基因型的關聯(lián)性分析采用協(xié)方差分析的方法，并將BMI作為協(xié)變量引入。 結果： 1、在PCOS病例組和對照組中，單核苷酸多態(tài)位點rs13266634的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。 2、在PCOS病例組與對照組中，rs13266634多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率的分布沒

5、有顯著差異。 3、在PCOS病例組中，rs13266634多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率在胰島素抵抗組和非胰島素抵抗組患者中的分布沒有顯著差異。 4、在PCOS病例組中，rs13266634多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率在肥胖組和非肥胖組患者中的分布沒有顯著差異。 5、在PCOS病例組中，PCOS患者的各種內(nèi)分泌及代謝特征表型與rs13266634多態(tài)位點的基因型分布之間沒有相關性。 結論：SLC

6、30A8基因中的單核苷酸多態(tài)位點rs13266634不是PCOS的疾病相關基因位點，未發(fā)現(xiàn)該位點的基因型分布與PCOS患者的內(nèi)分泌及代謝表型特征表型之間存在相關性。 第二部分雌激素對B細胞功能的調(diào)節(jié)作用 研究背景：系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種累及多系統(tǒng)、多臟器，臨床表現(xiàn)復雜多樣，病程遷延反復的自身免疫性結締組織病，由于患者體內(nèi)有大量致病性自身抗體和免疫復合物，可以造成組織損傷，臨床上會出現(xiàn)各系統(tǒng)和臟器損害的癥狀?；颊叩淖陨砜乖?/p>

7、要是細胞核內(nèi)的不溶性和可溶性成分、細胞膜成分、細胞內(nèi)其他成分等?；颊唧w內(nèi)的自身抗體主要有抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗單鏈DNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗rRNP抗體、抗磷脂抗體等。有色人種比白種人發(fā)病率高，我國的患病率約為70/10萬。本病女性患者約占90％，常為育齡期婦女，男女患病比為1：7～1：10。 SLE的病因至今尚未被明確闡明，可能與遺傳、環(huán)境、性激素等因素有關。SLE的發(fā)病機制

8、中有許多因素的參與，至今的研究認為，SLE是在由遺傳因素導致的遺傳易感性的基礎上，在病毒感染或體內(nèi)激素環(huán)境改變等促發(fā)因素的作用下，機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生功能紊亂，導致自身耐受喪失而引起的自身免疫性疾病。研究證明，多種免疫系統(tǒng)功能異常都在SLE的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，如，T、B細胞的過度活化，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞等抑制性免疫調(diào)節(jié)細胞功能減退，干擾素-α、IFN-γ、白細胞介素-6、IL-10等細胞因子分泌的異常，細胞凋亡異常，免

9、疫復合物清除能力下降等。 在眾多機制中，患者體內(nèi)B細胞過度活化，打破自身耐受，識別多種自身抗原，產(chǎn)生自身抗體，以及T、B細胞間相互作用的異常是SLE發(fā)病的核心事件。成熟的自身反應性B細胞產(chǎn)生的自身抗體以及循環(huán)中的免疫復合物可以直接造成機體組織器官的損傷，如皮膚和腎臟的損傷。B細胞還可以產(chǎn)生如腫瘤壞死因子、IL-4、IL-10等促炎細胞因子，促進炎癥反應。B細胞還可以作為抗原提呈細胞提呈抗原，表達主要組織相容性復合體Ⅱ類分子和CD

10、80、CD86分子等，從而影響其他免疫細胞的功能。B細胞功能異?？梢元毩⒂谄渌ｋU因素誘發(fā)狼瘡樣癥狀，B細胞這一經(jīng)典的免疫效應細胞已經(jīng)成為SLE治療的潛在靶點。 SLE具有明顯的女性傾向，育齡期男女患病比為1：9，而在絕經(jīng)期男女之比僅為1：3，女性的非性腺活動期，SLE的發(fā)病率顯著減少。這種傾向可能與女性激素的作用有關，在眾多的女性激素中，雌激素的作用最為重要，雌激素是SLE發(fā)病的危險因素之一。 雌激素具有免疫調(diào)節(jié)作用

11、。一般認為，生理水平的雌激素具有免疫活化作用，而高于生理水平的雌激素則具有免疫抑制作用。在中樞免疫器官，雌激素可以調(diào)節(jié)胸腺的發(fā)育和骨髓中各種免疫細胞的體細胞的發(fā)育。在外周免疫器官，雌激素可以調(diào)節(jié)多種成熟免疫細胞如T、B細胞、樹突狀細胞、單核巨噬細胞、自然殺傷細胞、粒細胞等的功能，可以抑制Th-1型細胞因子的分泌并促進Th-2型細胞因子的分泌。總的來說，雌激素的免疫調(diào)節(jié)作用是傾向于抑制細胞免疫而促進體液免疫。 雌激素具有的免疫調(diào)節(jié)

12、能力，特別是對B細胞功能的影響很可能是SLE發(fā)病的女性傾向特征的發(fā)生機制之一。目前的研究主要集中在雌激素對B細胞發(fā)育過程中的自身耐受形成的干擾作用，而在雌激素對外周成熟B細胞的功能的影響方面，目前尚未有全面的研究。在本研究中，我們著眼于雌激素對外周成熟B細胞功能的調(diào)節(jié)作用。 目的：通過研究雌激素對雌性BALB/c小鼠脾臟B細胞的增殖、活化、凋亡、分化及抗體合成功能的影響，全面觀察雌激素對外周成熟B細胞功能的潛在調(diào)節(jié)作用，從而探討

13、雌激素在SLE的發(fā)病和病情進展中可能發(fā)揮的作用。 研究方法：在無菌條件下分離雌性BALB/c小鼠的脾細胞，在無酚紅、含10％炭吸附處理的胎牛血清的液體RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并根據(jù)需要與不同濃度的不含內(nèi)毒素的、細胞培養(yǎng)級別的17β-雌二醇共培養(yǎng)，培養(yǎng)時間依據(jù)研究目的的不同而不同。小鼠脾細胞總IgG型抗體的合成用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測。小鼠脾臟B細胞的凋亡、活化及分化功能使用雙色熒光染色流式細胞術檢測，B細胞的增殖采用

14、活細胞熒光染料染色及流式細胞術檢測。 結果： 1、17β-雌二醇可使體外培養(yǎng)的小鼠脾細胞中的B220+/CD80+細胞減少，且可使B220+細胞表面CD80分子的表達密度降低，但17β-雌二醇對B220+細胞上CD86分子的表達沒有影響。 2、17β-雌二醇可使體外培養(yǎng)的血清缺乏誘導的小鼠脾B220+細胞的凋亡減少。 3、17β-雌二醇可以使體外培養(yǎng)的小鼠脾細胞總IgG型抗體的合成增加。 4、17