遼寧MSM人群HIV-1感染早期病毒env準(zhǔn)種演變與疾病進(jìn)展關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　 本研究以人免疫缺陷病毒（HIV-1）原發(fā)感染患者為研究對(duì)象，以前瞻性隊(duì)列研究的方式，高密度隨訪觀察感染早期病毒復(fù)制水平的動(dòng)態(tài)變化，以HIV-1基因組中膜蛋白編碼區(qū)gp160為研究目標(biāo)，經(jīng)TA克隆的方法獲取感染后最早時(shí)間點(diǎn)和病毒調(diào)定點(diǎn)時(shí)期的準(zhǔn)種序列，進(jìn)行個(gè)體內(nèi)病毒N-糖基化位點(diǎn)、輔助受體、遺傳多樣性、趨異性、特征性氨基酸變異及不同時(shí)間點(diǎn)的上述病毒特征演變分析，并分析上述各項(xiàng)指標(biāo)與病毒調(diào)定點(diǎn)高低的關(guān)系，以期從分子水平探

2、討HIV-1患者病毒調(diào)定點(diǎn)的形成機(jī)制，揭示HIV-1感染早期病毒的生物學(xué)特征、尋找保護(hù)性免疫應(yīng)答的相關(guān)因素，為HIV感染的治療和疫苗設(shè)計(jì)提供新的思路。
　　 方法：
　　 1、研究對(duì)象
　　 12例未經(jīng)抗病毒治療原發(fā)感染病例，分析并比對(duì)每例原發(fā)感染者最早時(shí)間點(diǎn)及setpoint點(diǎn)病毒env基因的變化。并根據(jù)HIV-1感染后4-24月內(nèi)，病毒載量相對(duì)穩(wěn)定，定義病毒載量調(diào)定點(diǎn)的時(shí)間。根據(jù)setpoint點(diǎn)病毒載量水平

3、分為高setpoint組（>4 log10copies/mL）和低setpoint組（<4 log10copies/mL）。
　　 2、CD4+T淋巴細(xì)胞測(cè)定
　　 20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，用FACS MMLTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析、計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞

4、絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。
　　 3、病毒載量測(cè)定
　　 以200μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor 1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自動(dòng)載量?jī)x上以RT-PCR方法測(cè)定病毒載量。檢測(cè)范圍為400-750，000copies/ml。
　　 4、病毒核酸提取、RT-PCR
　　 以抗凝140μl血漿提取病毒基因組RNA，按照QIAam

5、p Viral RNA Mini Kit說明書步驟提取RNA，提取物溶于60μl洗脫液中。RT反應(yīng)體系基于SuperScript○RⅢReverse Transcriptase Kit（invitrogen）
　　 5、巢氏聚合酶鏈反應(yīng)（nest-PCR）
　　 以外側(cè)引物對(duì)：AEOF（5’-TAGAGCCCTGGAATCATCCGGGAAG-3’HXB25853-5877nt）和AEOR（5'-TTACTACTTGTT

6、ACTGCTCCATGT-3’HIV-1 HXB28936-8913nt）；內(nèi)側(cè)引物對(duì)：UIF（5’-CACCTTAGGCATCTCCTATGGCAGG AAGAAG-3'HIV-1HxB27850-7879nt）和AEIR（5’-AGCTGGATCCGTCTTGAGATA CTGCTCCTAC-3'HIV-1HXB28914-8884nt），用于擴(kuò)增HIV-1 gp160序列。
　　 6、PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化
　　 取終

7、產(chǎn)物5m進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)Ultra-Violet Product凝膠成像后與marker比對(duì)，確認(rèn)所需片段，用QIAquik Gel Extraction Kit試劑盒純化基因片段。
　　 7、TA克隆
　　 擴(kuò)增的gp160基因3000bp片段插入克隆載體pMDTM18-T Simple Vector，轉(zhuǎn)入化學(xué)感受態(tài)菌DH5a擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒DNA雙脫氧終止法測(cè)序。
　　 8、序列分析
　

8、　 經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序得到HIV-1 gp41基因的基因序列片段，然后用Contig軟件進(jìn)行拼接，用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)。用MEGA 3軟件的進(jìn)行系統(tǒng)樹分析，并計(jì)算基因離散率及趨異性。使用網(wǎng)上工具（http：//www.hiv.lanl.gov）分析同義替代及非同義替代、Highlighter、N-Glycosite site。利用網(wǎng)絡(luò)工具IEDB Analysis Resource，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的患者HLA-Ⅰ等位

9、基因分型信息，預(yù)測(cè)樣本的HLA-Ⅰ限制性CTL表位，選取IC50低于50nM的表位進(jìn)行多肽特征和變異分析。使用Simplot軟件進(jìn)行重組斷點(diǎn)分析。使用Geno2pheno[coreceptor]軟件，進(jìn)行細(xì)胞嗜性的預(yù)測(cè)。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 用SPSS15統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差及中位數(shù)±95％可信區(qū)間；用non-parametric Wilcoxon rank-sum test分析不同時(shí)間點(diǎn)毒

10、株的PNGs數(shù)量和env區(qū)變異環(huán)長(zhǎng)度的不同；用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析；p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié) 果：
　　 一、膜蛋白基本特征
　　 1、env變異環(huán)的長(zhǎng)度分析
　　 在感染最早期，高病毒setpoint組V1、V2、V4區(qū)長(zhǎng)度有高于低病毒setpoint組趨勢(shì)，而v5區(qū)長(zhǎng)度有低于低病毒setpoint組趨勢(shì)，但上述差異均未達(dá)顯著性水平；在setpoint點(diǎn)，兩組上述各區(qū)域的變

11、化仍未發(fā)生顯著性差異。
　　 兩組隨著時(shí)間的推移各區(qū)的變化如下：在V1區(qū)，高病毒setpoint組無明顯變化，低病毒setpoint組V1有變短趨勢(shì)；V2區(qū)與V3區(qū)兩組均無明顯變化；V4區(qū)與V5區(qū)兩組均有變短趨勢(shì)，但差異均未達(dá)顯著性水平。
　　 2、N-糖基化位點(diǎn)（PNGs）
　　 在感染最早期，高病毒setpoint組V1、V2、V5區(qū)PNGs數(shù)量有低于低病毒setpoint組趨勢(shì)，而V3、V4區(qū)、gp41胞外

12、區(qū)PNGs數(shù)量有高于低病毒setpoint組趨勢(shì)，但上述差異均未達(dá)顯著性水平；在setpoint點(diǎn)，兩組在上述各區(qū)域的PNGs數(shù)量上仍無顯著性差異。
　　 兩組隨著時(shí)間的推移各區(qū)的變化如下：在高病毒setpoint組與低病毒setpoint組中V1區(qū)與V4區(qū)的PNGs均有減少趨勢(shì)；在V2區(qū)和gp41胞外區(qū)，高病毒setpoint組PNGs數(shù)量有增加趨勢(shì)，低病毒setpoint組則有減少趨勢(shì)；在V3區(qū)，高病毒setpoint組的P

13、NGs數(shù)量無明顯變化，低病毒setpoint組則有增加趨勢(shì)；在V5區(qū)，高病毒setpoint組的PNGs數(shù)量有減少趨勢(shì)，低病毒setpoint組則有增加趨勢(shì)，但上述差異均未達(dá)顯著性水平。
　　 3、細(xì)胞嗜性預(yù)測(cè)結(jié)果
　　 12例HIV-1原發(fā)感染者感染毒株在感染早期以CCR5嗜性的病毒株為主，占83.3％，高病毒病毒setpoint組病毒準(zhǔn)種全部為CCR5嗜性，低病毒setpoint組50％的感染者準(zhǔn)種為CXCR5。1例

14、經(jīng)異性性傳播感染者在感染早期病毒準(zhǔn)種為CCR5嗜性，但其setpoint時(shí)的病毒準(zhǔn)種轉(zhuǎn)變?yōu)镃XCR4嗜性。
　　 二、HIV-1 env進(jìn)化特征
　　 1、同一感染者個(gè)體內(nèi)最早期和調(diào)定點(diǎn)的病毒多樣性分析
　　 按照Fiebig分期比較，Ⅱ期時(shí)，高病毒setpoint組多樣性低于低病毒setpoint組；而在Ⅳ與Ⅳ期，高病毒setpoint組多樣性高于低病毒setpoint組。
　　 2、多樣性率
　

15、　 高病毒setpoint組多樣性率與低病毒setpoint組多樣性率無顯著性差異（p=0.458）
　　 3、核苷酸趨異性和氨基酸趨異性分析
　　 高病毒setpoint組趨異性有高于低病毒setpoint組的趨勢(shì)（P=0.105）。線性回歸模型提示基因距離與VL的對(duì)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.162，p=0.157）。高病毒setpoint組比低病毒setpoint組具有較高的氨基酸趨異性（p=0.157），與基因趨異性具

16、有相同的特點(diǎn)。
　　 4、dN/dS ratios
　　 高病毒setpoint組dN/dS顯著高于低病毒setpoint組（p=0.002）；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)高病毒setpoint組dS同樣高于低病毒setpoint組dS（p<0.001）。而高病毒setpoint組dN和低病毒setpoint組dN具有相似性（P=0.308）。
　　 5、不同感染者體內(nèi)同源病毒進(jìn)化差異的研究
　　 通過流行病學(xué)及全長(zhǎng)en

17、v基因分析發(fā)現(xiàn)12例原發(fā)感染者中存在2對(duì)同源傳播對(duì)，其中一對(duì)為高度同源株單一病毒株傳播，而另外一對(duì)情況較復(fù)雜，其中一例為單一病毒株傳播，另一例則感染了2株病毒，其感染先后時(shí)序不明。
　　 結(jié)論：
　　 1、遼寧MSM人群HIV-1 AE亞型原發(fā)感染者，單一病毒株的感染比較普遍。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)了一例2種毒株感染的個(gè)體。
　　 2、原發(fā)感染者，setpoint點(diǎn)和最早期相比，變異環(huán)長(zhǎng)度和PNGs數(shù)量沒有變化或者變化