RA通過(guò)RAR_上調(diào)TLR4促進(jìn)腸上皮間ZO-2表達(dá).pdf

1、目的：
　　明確TLR4在RA調(diào)控RARβ促進(jìn)緊密連接蛋白ZO-2表達(dá)過(guò)程中的作用。
　　方法：
　　1.體外：RA處理Caco-2細(xì)胞后，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中zonulin的濃度；激光共聚焦結(jié)果檢測(cè)RARβ、TLR4和ZO-2在Caco-2細(xì)胞中的共定位；Real-time PCR和Western blotting檢測(cè)Lv-siTLR4感染的Caco-2穩(wěn)定細(xì)胞株中RARβ、ZO-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。<

2、br>　　2.體內(nèi)：針對(duì)野生型和TLR4 knockout小鼠分別構(gòu)建7周大VA正常（VAN）和VA缺乏（VAD）小鼠模型，高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)各組小鼠血清視黃酸水平；Ussing chamber檢測(cè)其結(jié)腸組織跨上皮電阻（TER）的變化；Real time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)腸粘膜層RARβ、TLR4和ZO-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化；透射電鏡（TEM）觀察各組結(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)改變。
　

3、　結(jié)果：
　　1.RA處理后，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)液中zonulin的濃度明顯降低（P=0.043）。激光共聚焦觀察到Caco-2細(xì)胞中RARβ和TLR4在核周和細(xì)胞膜上具有共定位表達(dá)，TLR4和ZO-2共表達(dá)于細(xì)胞膜上，而RARβ和ZO-2在Caco-2細(xì)胞上幾乎沒(méi)有共定位表達(dá)。Lv-siTLR4感染Caco-2穩(wěn)定細(xì)胞株經(jīng)RA處理后，盡管RARβmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，但ZO-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均隨TLR4的阻

4、斷而顯著降低。
　　2.VA缺乏的7周齡野生型（WT）和TLR4 knockout（TLR4KO）小鼠血清視黃醇水平均顯著低于VA正常小鼠（P＜0.0001，P=0.009）。WT小鼠中VAD組的TER顯著低于VAN組（P=0.002），而TLR4KO小鼠中VAD組和VAN組TER并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，WT小鼠中VAD組結(jié)腸粘膜層中的RARβ、TLR4和ZO-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較VAN組顯著降低，TLR4KO小

5、鼠中VAD組結(jié)腸粘膜層中的RARβmRNA和蛋白表達(dá)水平均較VAN組顯著降低，但ZO-2的表達(dá)水平卻與VAN組無(wú)顯著差異。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，VAN WT小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)致密、完整，VAD WT的緊密連接結(jié)構(gòu)疏松、不完整；而TLR4KO小鼠中VAN與VAD兩組間的緊密連接結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　當(dāng)RA激活RARβ信號(hào)通路時(shí)，siTLR4可下調(diào)腸上皮細(xì)胞間的ZO-2表達(dá)水平；而VA不同營(yíng)養(yǎng)水平并不影響TL