抗轉鐵蛋白受體單鏈抗體的構建、表達及在INTERNET上的3D模建分析.pdf

1、根據(jù)測序結果,設計鼠源性單抗重輕鏈可變特異性引物,從該室已構建的抗轉鐵蛋白受體(TFR)單克隆抗體VH、VL克隆載體上擴增VH、VL基因,利用SOE法構建其單鏈抗體VH-Linker-VL,經Sfi I和Not I雙酶切,連至表達載體pUC19/119上,經轉化大腸桿菌TGl,通過菌落PCR篩選陽性克隆,采用熒光染色鏈終止法測定scFv序列,從Internet網上下載DNA分析工具與其來源基因進行分析比較,發(fā)現(xiàn)基本吻合,同時Linker

2、序列為GGGGSGGGGSSGGGS,提示 單鏈抗體基因構建成功.陽性菌落用IPTG誘導表達,經SDS-PAGE蛋白電泳,在約26kD處可見條帶,采用間接免疫熒光抑制試驗和間接免疫熒光試驗,證實此單鏈抗體可特異性與TFR+細胞結合.利用Internet網上日內瓦生物攻學研究所開發(fā)的ExPASy分子生物學服務器,對scFv基因的氨基酸序列進行分析,包括理化特性分析、氨基酸組成和分子量分析、序列統(tǒng)計學分析等.同時,利用蛋白質結構同源性模建(

3、Swiss-Model)系統(tǒng)做了VH-Linker-VL、VL-Linker-VH、VH-VL、VL-VH的蛋白質分子3D模建.利用英國Bath大學開發(fā)的WAM服務系統(tǒng),對其來源抗體進行模建.使用Spdbv軟件對上述各模型結構進行比較,發(fā)現(xiàn)抗TFR單抗VH、VL在此單鏈抗體中的順序對對單鏈抗體的結構有結構有所影響.該研究采用的分子生物學技術及利用Internet上的服務系統(tǒng)、在線數(shù)據(jù)庫和共享軟件等網絡工具,為單鏈抗體的構建及其理論分析提