肝癌門靜脈癌栓相關(guān)小分子蛋白標(biāo)記物的研究及S100A11的功能驗證.pdf

1、原發(fā)性肝癌是居中國第二位的惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)肝癌的一半以上發(fā)生在我國。肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)易于侵犯門靜脈形成癌栓(portal vein tumor thrombus，PVTT)導(dǎo)致腫瘤細胞的播散和轉(zhuǎn)移。至今仍然難有一種手段能夠早期發(fā)現(xiàn)或預(yù)測PVTT的形成。PVTT的形成是多因素、多步驟的生物學(xué)現(xiàn)象，單因素和局限在基因水平的研究難以全面揭示PVTT形成的分子機制，對PVTT的研究必

2、須建立在高通量的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)上。 雙向凝膠電泳 (two-dimensional electrophoresis，2-DE) 和質(zhì)譜 (massspectrometry， MS)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用為蛋白質(zhì)組的分析提供了研究平臺。本研究利用低分子量2-DE結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS/MS)，對有或無PVTT的原發(fā)瘤組織中的蛋白質(zhì)組進行比較，篩選出有差異的小分子蛋白，并利用RNA干擾技術(shù)對其

3、中的S100A11蛋白進行了初步的細胞功能學(xué)驗證，發(fā)現(xiàn)其可能與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性相關(guān)。利用組織芯片技術(shù)對S100A11的臨床驗證發(fā)現(xiàn)，S100A11的表達與肝癌的侵襲性相關(guān)，S100A11陽性表達可能是肝癌預(yù)后不良的潛在指標(biāo)。 第一部分 肝癌門靜脈癌栓相關(guān)小分子的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析 本部分通過改變雙向電泳第二向SDS-PAGE膠濃度和電泳緩沖系統(tǒng)成分，優(yōu)化2-DE相關(guān)技術(shù)，建立分子量低于20kD蛋白質(zhì)電泳技術(shù)平臺。

4、然后應(yīng)用相對穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的2-DE及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS/MS)對有或無PVTT的人肝癌原發(fā)瘤組織中的差異蛋白質(zhì)組進行分析比較，篩選在PVTT形成過程中起重要作用的低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)記物。 結(jié)果： 1． 16％SDS-PAGE凝膠中，3～20kD區(qū)域內(nèi)蛋白條帶間距較12.5％SDS-PAGE明顯變寬，條帶數(shù)目明顯增多；兩組肝癌組織小分子量蛋白表達圖譜中均可以清晰顯示分子量低20kD的小分子

5、蛋白斑點。 2．相同條件下分別對無PVTT組和PVTT組的蛋白質(zhì)樣品重復(fù)進行3次2-DE，無PVTT組平均檢測到764±56個蛋白點(n=3)，PVTT組平均檢測到799±44個蛋白點(n=3)，以每組蛋白點最多最清晰的膠作為組內(nèi)參考膠，無PVTT組的平均匹配點數(shù)為687±30個，PVTT組的平均匹配點數(shù)為701±21個，組內(nèi)匹配率分別為89.87％和87.77％。 3. 以PVTT 組內(nèi)參考膠作為組間參考膠，兩組間平均

6、匹配點數(shù)為393±42個，組間匹配率為51.44％。不同凝膠之間蛋白質(zhì)斑點的位置偏差I(lǐng)EF(等電聚焦)方向為(2.95±0.95) mm，SDS-PAGE方向為(2.87±0.88) mm。以蛋白質(zhì)點的膠內(nèi)校正強度值進行組間比較，比值大于等于2倍者被定義為差異點，無PVTT和PVTT的原發(fā)瘤組織間共檢測到88個差異點，其中分子量低于20kD的差異點有42個。與無PVTT組相比，PVTT組中有41個蛋白點表達上調(diào)(其中19個分子量低于20

7、kD)，47個蛋白點表達下調(diào)(23個分子量低于20kD)。 4.挖取其中36個差異蛋白點并經(jīng)質(zhì)譜鑒定，去除冗余后共發(fā)現(xiàn)鈣結(jié)合蛋白S100A11，脂肪酸結(jié)合蛋白-1等11種膠內(nèi)差異小分子蛋白質(zhì)。 5.Western blot驗證結(jié)果證實S100A11在有或無PVTT的原發(fā)瘤組織中的確存在表達差異。 第二部分 差異表達蛋白S100A11在侵襲轉(zhuǎn)移潛能不同的人肝癌細胞系中的表達和功能驗證 本部分解析差異蛋白S1

8、00A11的生物學(xué)功能，證實其是否在肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。首先選擇Hep3B、MFtCC97L、MHCC97H和HCCLM6等4種侵襲轉(zhuǎn)移潛能不同的人肝癌細胞系，驗證S100A11在細胞系中的差異表達，然后化學(xué)合成三組S100A11的siRNA，以脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染高侵襲轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系HCCLM6，篩選出干擾效果明顯的兩組siRNA，通過細胞運動實驗、細胞侵襲實驗、細胞劃痕實驗等檢測，觀察目的蛋白S100A11表達下調(diào)后對HC

9、CLM6細胞生物學(xué)行為的影響。 結(jié)果： 1.應(yīng)用refl-time PCR和Westernblot檢測S100A11在4種侵襲轉(zhuǎn)移潛能不同人肝癌細胞系Hep3B、MttCC97L、MHCC97H和HCCLM6中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A11在4種細胞系中存在表達差異，表達量隨細胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能增強而升高。 2.三對siRNA中S100A11表達的抑制率分別為 73.1％，88.6％和91.0％，與陰性對照siR

10、NA相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。在細胞融合度為40～50％、siRNA濃度為100nM、轉(zhuǎn)染時間為48h的條件下，S100A11表達的抑制效果最佳。 3.細胞侵襲實驗結(jié)果顯示穿過人工基底膜細胞數(shù)在兩組S100A11干擾組中為55.0±10.0和41.0±5.6，陰性對照組中為153.0±11.0，空白對照組中為165.0±7.2，干擾組穿越的細胞顯著減少(P<0.05)。 4.細胞運動實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞穿過

11、上室底膜的細胞數(shù)在兩組S100A11干擾組中為96.0±9.7和78.0V14.0，陰性對照組中為211.0±18.1，空白對照組中為225.0±15.8，干擾組穿越的細胞顯著減少(P<0.05)。 5.細胞劃痕實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制細胞分裂48h后細胞遷移距離在S100A11干擾組中為35.00±11.07岬，陰性對照組中為81.98±12.11μm，空白對照組中為119.98±8.17μm，干擾組的細胞遷移速度顯著降低(P<0.0

12、5)。 第三部分 S100A11在肝癌原發(fā)瘤組織中的表達狀況及臨床意義 本部分利用組織芯片和免疫組化技術(shù)檢測192例肝癌原發(fā)瘤組織中S100A11的表達情況，比較分析S100A11的表達與PVTT和其他臨床病理特征的關(guān)系，以以受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC curve)比較肝癌原發(fā)瘤組織與癌旁組織中S100A11表達與肝癌侵襲的相關(guān)性，評價S1

13、00A11作為肝癌預(yù)后判斷指標(biāo)的意義。 結(jié)果： 1.S100A11在肝癌組織中表達陽性率為43.75％，在無癌栓組、鏡下癌栓組和肉眼癌栓組中的表達依次增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 2.S100A11升高與單個腫瘤最大直徑>5cm、病理低分化、腫瘤無完整包膜、腫瘤邊界不清、腫瘤侵犯血管、存在播散灶以及腫瘤TNM分期晚等臨床病理因素相關(guān)(P<0.05)。 3.ROC曲線提示腫瘤組織中S100A1

14、1的表達越高，肝癌的侵襲力越強。 結(jié)論： 1.16％的SDS-PAGE結(jié)合Tris-Tricine電泳緩沖系統(tǒng)能夠良好的顯示分子量低于20kD的蛋白和多肽。PVTT 的原發(fā)瘤組織與無PVTT 原發(fā)瘤組織中存在差異表達的低分子量蛋白，推測有多種差異蛋白與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移特性相關(guān)，S100A11可能是其中一種。 2.人肝癌細胞系中S100A11表達量的高低與細胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能強弱相關(guān)。抑制高侵襲轉(zhuǎn)移潛能細胞中S100A1

15、1的表達可以降低其運動侵襲能力，提示差異蛋白S100A11通過增強肝癌細胞的運動侵襲能力來參與肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程，可能與PVTT的形成有一定關(guān)聯(lián)。 3.S100A11在預(yù)測肝癌的侵襲力中具有一定的臨床意義，S100A11陽性表達是肝癌預(yù)后不佳的信號。聯(lián)合分析S100A11與其他臨床病理指標(biāo)，對于判斷患者術(shù)前是否已有血管侵犯以及術(shù)后是否有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能，以便及早采取針對性干預(yù)措施具有一定的參考價值。 潛在應(yīng)用價值：

16、 1．S100A11可作為腫瘤侵犯血管及肝癌轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)志物及肝癌預(yù)后指標(biāo)。 2．對S100A11的上游和下游調(diào)控的進一步研究，有助于揭示PVTT形成以及肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。 創(chuàng)新點： 1．對現(xiàn)有蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進行改進，使之更適合低分子量蛋白和多肽的分離篩選，為研究小分子蛋白標(biāo)記物奠定基礎(chǔ)。 2．首次證實差異蛋白S100A11在人肝癌細胞系侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。 3．S100A11可能成為預(yù)