肢體缺血預(yù)適應(yīng)大鼠血清對HUVEC和H9c2(2-1)細(xì)胞H2O2損傷的保護(hù)作用及機制研究.pdf

1、研究背景
　　細(xì)胞內(nèi)ROS（reactiveoxygenspecies）的產(chǎn)生處于動態(tài)平衡狀態(tài)。缺血再灌注時細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，造成氧化應(yīng)激損傷，即缺血再灌注損傷。輕度短暫的組織缺血再灌注可以減輕隨后發(fā)生的嚴(yán)重的組織缺血再灌注損傷，這種現(xiàn)象稱為缺血預(yù)適應(yīng)（Ischemicpreconditioning，IPC)。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷小，操作方便的肢體缺血預(yù)適應(yīng)（Limbischemicpreconditioning,LIPC），可以

2、減輕多種動物多個器官的缺血再灌注損傷。血液中ROS增加,易導(dǎo)致內(nèi)皮損傷,加重缺血再灌注損傷。LIPC可以調(diào)節(jié)正常內(nèi)皮功能，對內(nèi)皮ROS損傷是否有作用目前尚無詳細(xì)報道。
　　CAT，SOD，GSH-Px等是細(xì)胞內(nèi)重要的清除ROS的抗氧化酶。細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶受到轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(NF-E2-relatedfactor2)的調(diào)控。Nrf2通過與抗氧化反應(yīng)元件(Antioxiantresponseelement,ARE)結(jié)合，上調(diào)與ARE

3、相關(guān)的抗氧化基因表達(dá)，包括細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶等，清除細(xì)胞內(nèi)過多地ROS，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平，減輕氧化應(yīng)激所造成的細(xì)胞損傷。受Nrf2調(diào)控的蛋白持續(xù)表達(dá)增加對細(xì)胞氧化還原內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起到非常關(guān)鍵的作用。
　　研究目的
　　本課題主要觀察LIPC大鼠的血清是否可以減輕H2O2所導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC和鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2（2-1）的氧化應(yīng)激損傷，分析Nrf2所調(diào)控的抗氧化基因是否參與了該過程，以及有可

4、能所涉及的信號通路。
　　材料和方法
　　（1）成年健康SD大鼠，用改良的大鼠尾動脈血壓測定儀套管套在大鼠右后肢，加壓至200mmHg阻斷股動脈造成右后肢短暫缺血，持續(xù)5分鐘，放氣減壓恢復(fù)血流，持續(xù)10分鐘，共3個循環(huán)。預(yù)適應(yīng)結(jié)束后立即腹主動脈無菌采血獲得大鼠早期肢體預(yù)適應(yīng)血清。預(yù)適應(yīng)后間隔24小時采血，獲得大鼠延遲肢體預(yù)適應(yīng)血清，分裝凍存于-80℃。
　?。?）建立HUVEC和H9c2（2-1）細(xì)胞的H2O2損傷模型

5、，參考IC50作為后續(xù)實驗造模濃度。HUVEC和H9c2（2-1）細(xì)胞分為5組，對照組（control，C），模型組（model，M），大鼠早期預(yù)適應(yīng)血清組（preconditioningserum,PS），大鼠延遲預(yù)適應(yīng)血清組(delayedpreconditioningserum,DPS)，正常大鼠血清組（normalratserum,NRS），預(yù)先用2.5％,5%（V/V）各種血清孵育6小時和12小時，然后用H2O2處理2小時，用

6、MTT法檢測各種血清預(yù)處理對HUVEC和H9c2（2-1）細(xì)胞活性的影響。
　?。?）應(yīng)用AnnexinV-FITC和PI雙染進(jìn)一步檢測細(xì)胞的凋亡情況。
　?。?）細(xì)胞處理完成后，用8μM的DHE孵育45分鐘，熒光顯微鏡下檢測ROS的含量。
　?。?）應(yīng)用LDH，MDA，CK檢測試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH，CK的活性及MDA的濃度。
　?。?）采用SOD，CAT，GSH-Px檢測試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中S

7、OD，CAT，GSH-Px的活性。
　?。?）采用免疫熒光法和激光共聚焦顯微鏡檢測各組細(xì)胞Nrf2的核轉(zhuǎn)位情況。
　?。?）采用real-timeRT-PCR檢測各組細(xì)胞中抗氧化基因CAT，HO-1，SOD1，SOD2，GSH-Px1mRNA的水平。
　?。?）采用WesternBlot法檢測各組細(xì)胞中CAT，HO-1，SOD1，SOD2的蛋白表達(dá)情況。
　?。?0）用25μMPI3K的抑制劑LY294002和2

8、6μMMEK1/2抑制劑U0126提前1小時處理細(xì)胞，觀察這兩種抑制劑對PS和DPS作用的影響。
　?。?1）各實驗組數(shù)據(jù)采用mean±SD表示，利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，組間差異比較采用單因素方差分析。P<0.05認(rèn)為有顯著差異。
　　結(jié)果
　?。?）不同濃度的H2O2（100-1200μM）作用2小時后，隨H2O2濃度增高HUVEC和H9c2（2-1）細(xì)胞存活逐漸降低，IC50分別為1099.56±109.

9、11μM和380.98±57.44μM，參考IC50選取1000μM和400μM作為造模濃度。
　?。?）對于H9c2（2-1）細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞，2.5%PS，DPS，NRS預(yù)孵育6小時和12小時，400μM和1000μMH2O2處理2小時，MTT570nm處吸光度測定結(jié)果顯示，M組比C組顯著降低（P<0.001），PS，DPS，NRS組的吸光度與M組相比無顯著差異（P>0.05）。
　　（3）5%的各血清預(yù)孵育6小時，

10、400μM和1000μMH2O2處理2小時，H9c2（2-1）細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞MTT570nm處吸光度測定結(jié)果顯示，M組比C組顯著降低（P<0.001）。PS，DPS，NRS組的吸光度與M組相比無顯著差異(P>0.05)。
　?。?）5%的各血清預(yù)孵育12小時，H2O2處理2小時，MTT570nm處吸光度測定結(jié)果顯示，H9c2（2-1）M組吸光度顯著低于C組（0.51±0.03vs1.20±0.09，P<0.001），PS組和

11、DPS組吸光度分別為1.14±0.17和1.08±0.23，顯著高于M組（P<0.001），PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組吸光度0.53±0.04，與M組相比無顯著性差異(P>0.05)。
　　HUVEC細(xì)胞M組吸光度顯著低于C組（0.78±0.03vs1.26±0.06，P<0.001），PS組和DPS組吸光度分別為1.09±0.04和1.08±0.04，顯著高于比M組（P<0.001），PS組和DPS

12、組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組吸光度0.75±0.03，與M組相比無顯著性差異(P>0.05)。
　?。?）5%的各血清預(yù)孵育12小時，H2O2處理2小時，H9c2(2-1)細(xì)胞PS組、DPS組和M組的早期凋亡率分別為2.74±1.28%、5.22±2.09%和12.28±3.24%（P<0.001，P<0.05）；PS組、DPS組和M組晚期凋亡率分別為6.87±0.88%，8.90±0.65%和36.04±6.22%

13、（P<0.001）；PS組、DPS組和M組總死亡率為9.61±0.93%，14.12±1.43%，48.31±3.33%（P<0.001）。PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組的早期凋亡，晚期凋亡和總死亡率與M組比較無顯著差異(P>0.05)。
　　HUVEC細(xì)胞PS組、DPS組的早期凋亡率分別為1.12±0.20%、1.78±0.20%與M組13.24±1.37%相比，顯著降低（P<0.01）；PS組和DPS

14、組晚期凋亡率7.54±1.49%和6.87±1.48%，與M組晚期凋亡率25.52±0.86%相比，顯著降低（P<0.001，P<0.01）；PS組和DPS組總死亡率為8.65±1.67%和9.65±1.44%，與M組總死亡率38.76±2.23%相比，顯著降低（P<0.001）。PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組的早期凋亡率，晚期凋亡率和總死亡率與M組比無顯著差異(P>0.05)。
　?。?）5%的各血清預(yù)

15、孵育12小時，H2O2處理2小時，H9c2(2-1)細(xì)胞M組熒光亮度與C組比顯著升高（96.34±21.23vs23.67±6.5，P<0.01）。PS組和DPS組熒光亮度29.87±5.67和30.67±7.34比M組顯著降低（P<0.01）。PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組熒光亮度為88.67±19.21，與M組相比無顯著性差異(P>0.05)。
　　HUVEC細(xì)胞M組熒光亮度76.34±19.23比C

16、組20.16±4.5顯著升高（P<0.01）。PS組和DPS組熒光亮度22.87±6.78和24.46±8.12比M組顯著降低（P<0.01）。PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組熒光亮度為71.34±16.19，與M組比無顯著性差異(P>0.05)。
　?。?）5%的各血清預(yù)孵育12小時，H2O2處理2小時，H9c2(2-1)細(xì)胞M組MDA濃度從4.42±0.28nmol/ml升高至8.74±0.33nmol

17、/ml（P<0.001）。PS組和DPS組MDA濃度則降至3.48±0.46nmol/ml和3.55±0.68nmol/ml（P<0.001），PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。而NRS組的MDA為8.54±1.08nmol/ml，與M組比無顯著差異（P>0.05）。
　　HUVEC細(xì)胞M組MDA濃度從4.86±0.28nmol/ml升高至6.67±0.29nmol/ml（P<0.001）。而PS組和DPS組MDA濃

18、度則降至3.44±0.27nmol/ml，3.80±0.42nmol/ml（P<0.001），PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組的MDA濃度為6.25±0.59nmol/ml，與M組比無顯著差異（P>0.05）。
　　5%的各血清預(yù)孵育12小時，H2O2處理2小時，H9c2(2-1)細(xì)胞的LDH濃度從72.69±6.75U/L升高至191.93±36.52U/L（P<0.001）；PS組和DPS組LDH則降至

19、77.81±13.58U/L，105.75±8.67U/L（P<0.001），PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。而NRS組的LDH為173.86±36.17U/L，與M組比無顯著差異（P>0.05）。
　　HUVEC細(xì)胞的LDH含量12.58±2.74U/L升高至58.16±5.05U/L（P<0.001）。而PS組和DPS組LDH則降至16.51±4.63U/L和15.54±2.70U/L（P<0.001）。PS組

20、和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。而NRS組的LDH為62.13±11.95U/L，與M組比無顯著差異（P>0.05）。
　　400μMH2O2處理H9c2（2-1）細(xì)胞2小時，細(xì)胞培養(yǎng)液中的CK顯著升高（15.67±0.91U/Lvs30.47±1.76U/L，P<0.001），PS和DPS預(yù)先處理12小時，則細(xì)胞培養(yǎng)液中的CK降低至20.08±1.26U/L和22.00±1.52U/L（P<0.001）。PS組和DPS

21、組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS預(yù)先處理12小時，則細(xì)胞培養(yǎng)液中的CK為29.47±2.26U/L，與M組30.47±1.76U/L相比，無顯著差異（P>0.05）。
　　（8）5%的各血清預(yù)孵育12小時，H2O2處理2小時，H9c2(2-1)細(xì)胞CAT的活性PS組和DPS組為45.33±3.82U/ml和44.61±5.79U/ml比M組17.30±1.62U/ml顯著增高(P<0.01，P<0.05），PS組和DPS組

22、相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組為17.92±2.17U/ml，與M組比無顯著差異（P>0.05）。HUVEC細(xì)胞CAT的活性PS組和DPS組為51.25±4.82U/ml和50.5±5.89U/ml比M組21.69±2.02U/ml高(P<0.01,P<0.05），PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組為25.81±4.40U/ml，與M組比無顯著差異（P>0.05）。
　　H9c2(2-1)細(xì)胞SOD

23、的活性PS組和DPS組為14.02±1.68U/ml和14.11±0.58U/ml，比M組6.89±0.97U/ml顯著增高(P<0.001），PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組為7.56±1.24U/ml，與M組比無顯著差異（P>0.05）。HUVEC細(xì)胞CAT的活性PS組和DPS組為13.82±0.50U/ml，11.29±3.58U/ml比M組6.43±0.78U/ml顯著增高(P<0.001，P<0.05）

24、，PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組為7.74±2.02U/ml，與M組比無顯著差異（P>0.05）。
　　H9c2(2-1)細(xì)胞GSH-Px的活性PS組和DPS組為43.27±8.56U/ml，37.62±6.00U/ml，比M組15.06±7.09U/ml顯著增高(P<0.01），PS組和DPS組相比無顯著差異(P>0.05)。NRS組為21.89±3.97U/ml，與M組比無顯著差異（P>0.05）。H