大環(huán)內(nèi)酯類藥物F806抗腫瘤活性與其作用分子機(jī)制.pdf

1、目前，食管癌的分子靶向治療已進(jìn)入I/II期臨床試驗階段，所用藥物主要包括受體激酶抑制劑和腫瘤血管生成抑制劑。然而，就目前的實驗數(shù)據(jù)來看，多數(shù)藥物對食管癌的療效并不顯著，且研究主要集中在西方國家常見的食管腺癌及胃食管交界癌，而中國等亞洲國家相對高發(fā)的食管鱗癌(ESCC)方面的分子靶向治療藥物研究尚十分缺乏，因此，探索和開發(fā)針對ESCC的分子靶向治療藥物迫在眉睫。F806是從國內(nèi)土壤鏈霉菌FIM-04-806發(fā)酵液中提取得到的天然化合物。初

2、步的實驗數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)806具有潛在的抗癌活性。然而，在ESCC中，其體內(nèi)外抗癌活性、安全性以及分子作用機(jī)制等均不清楚?；诖?，在本文中，我們利用ESCC等多種惡性腫瘤細(xì)胞系與非腫瘤細(xì)胞系，同時建立荷瘤鼠模型，綜合評價了 F806的體內(nèi)外抗 ESCC等的活性與安全性；在此基礎(chǔ)上，再通過聯(lián)合應(yīng)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)和蛋白質(zhì)譜等多種實驗技術(shù)手段，深入揭示了F806的分子作用機(jī)制及其潛在的作用靶點，為將其作為抗ESCC候選藥物，開展后續(xù)

3、的開發(fā)研究提供了充分的理論依據(jù)。
　　首先，在以ESCC為主的各種惡性腫瘤細(xì)胞系與非腫瘤細(xì)胞系中，應(yīng)用MTT法初步篩選了F806對細(xì)胞分裂增殖的影響。實驗結(jié)果顯示，1) F806對ESCC細(xì)胞等13種癌細(xì)胞系的分裂增殖均有明顯的抑制作用，72 h的IC50在0.83-16.43μM之間，表明擁有廣譜抗癌活性；2) F806在抗癌活性劑量濃度下，對6種非腫瘤細(xì)胞系的抑制作用不明顯。
　　其次，通過聯(lián)合應(yīng)用荷瘤鼠模型、病理學(xué)細(xì)胞

4、形態(tài)觀察與生化分析等實驗技術(shù)手段，探討了F806的體內(nèi)抗腫瘤活性與毒性。實驗結(jié)果表明，1)在ESCC荷瘤鼠模型中，F(xiàn)806在4 mg/kg和8 mg/kg的劑量濃度下，能夠顯著抑制癌細(xì)胞的成瘤能力，顯示其擁有很強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性；2)在抑制荷瘤鼠成瘤的過程中，F(xiàn)806有效劑量濃度并未對荷瘤鼠的肝、腎、心和腦等器官組織呈現(xiàn)明顯毒性作用。
　　再次，以兩種食管癌細(xì)胞系為模型，運用透射電鏡、DNA Ladder瓊脂糖凝膠電泳、TUNEL

5、與細(xì)胞周期分析、蛋白免疫印跡等實驗技術(shù)手段，研究發(fā)現(xiàn)，在 ESCC細(xì)胞中，F(xiàn)806可通過活化Caspase-9/12介導(dǎo)的線粒體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過綜合運用“失巢凋亡”分析、粘附實驗、免疫熒光、免疫共沉淀和蛋白免疫印跡等實驗技術(shù)手段，闡明了F806能夠抑制ESCC細(xì)胞中整合素β1的活性，阻斷整合素信號通路活化，抑制癌細(xì)胞中粘著斑的形成，影響癌細(xì)胞與 ECM之間的粘附，誘發(fā)癌細(xì)胞發(fā)生“失巢凋亡”，發(fā)揮抗

6、癌活性。
　　再者，以ESCC細(xì)胞系EC109為模型，運用SILAC與蛋白質(zhì)譜等實驗技術(shù)，鑒定了F806抑制ESCC細(xì)胞生長的差異蛋白表達(dá)譜。實驗結(jié)果顯示，共有1931個蛋白分子被鑒定并定量，其中181個蛋白發(fā)生顯著下調(diào)表達(dá)，119個蛋白發(fā)生顯著上調(diào)表達(dá)；運用Gene Ontology(GO)在線軟件對發(fā)生顯著差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行注釋分析，結(jié)果表明，F(xiàn)806作用的差異表達(dá)蛋白與細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程密切相關(guān)；應(yīng)用SubpathwayM

7、iner軟件對這些差異表達(dá)蛋白相關(guān)信號通路進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，在富集的37個信號通路與56個子通路中，發(fā)生下調(diào)表達(dá)的 GRB2可能是 F806發(fā)揮其抗癌作用的關(guān)鍵節(jié)點分子。接下來，通過qRT-PCR、蛋白免疫印跡與荷瘤鼠動物模型等實驗技術(shù)手段，驗證了 F806的確能夠誘導(dǎo)GRB2表達(dá)下調(diào)。并且，以shRNA穩(wěn)定敲降 GRB2的ESCC細(xì)胞建立荷瘤鼠模型，確認(rèn)GRB2表達(dá)下調(diào)能夠抑制ESCC細(xì)胞生長，進(jìn)一步驗證了F806通過抑制GRB2表達(dá)

8、發(fā)揮抗癌作用這一實驗事實。
　　最后，通過組織芯片、IHC染色和生存率分析等手段，闡明了GRB2在食管癌中的表達(dá)模式以及與患者生存率的關(guān)系，確認(rèn)其可作為抗癌治療的靶點。實驗結(jié)果表明，1)與配對的相對正常的食管上皮相比，GRB2在172例ESCC組織的胞漿中呈顯著過表達(dá)；2) GRB2過表達(dá)與ESCC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)；3) GRB2過表達(dá)與ESCC患者生存時間縮短顯著正相關(guān)，是判斷食管癌患者不良預(yù)后的獨立指標(biāo)。