SSH法檢測結(jié)腸正常粘膜、腺瘤和腺癌中差異表達(dá)的基因.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文SSH法檢測結(jié)腸正常粘膜、腺瘤和腺癌中差異表達(dá)的基因姓名：羅敏捷申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：來茂德2000.5.1塑望盔蘭豎主蘭堡墮塞一膜、腺瘤和腺癌組織的eDNA。運(yùn)用SSH法篩選差異表達(dá)的基因，并構(gòu)建三個相應(yīng)的差減文庫，即以腺瘤為檢測eDNA、遠(yuǎn)端粘膜為驅(qū)趕eDNA的差減A—N文庫：以腺癌為檢測eDNA、遠(yuǎn)端粘膜為驅(qū)趕eDNA的差減TN文庫和以腺癌為檢測eDNA、腺瘤為驅(qū)趕eDNA的差減TA文庫。

2、(將文庫進(jìn)行差減效率分析后，TA克隆。井對克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙向DotBlot雜交篩選。選取部分陽性克隆測序，與GeneBank同源比較，VirtualNorthernBlot和RNADotBlot驗證差異表達(dá)的基因。在差減AN，TA和TN文庫中分別篩選到4102，3102和35x102個克隆，片段長度在021Kb間。差減效率分析表明非差異表達(dá)基因已被有效消減；正向差減和反向差減eDNA文庫探針雙向雜交篩選文庫克隆，篩選到的克隆陽性率

3、為90％；測序驗證，多數(shù)克隆僅被篩選I2次：同源查尋表明部分為未知序列，可能為新基因而大部分已知基因均己報道與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)；VirtualNorthernBlot和RNADotBlot表明部分克隆在相應(yīng)組織中的差異表達(dá)。所查尋的基因見下表：同源搜索結(jié)果CloneInscrt(bp)HomologousGene(Accessioncode)Score。EvalueMatch2Subtract它dA—NcDNALibraryaAl085

4、0HumanDNAsequenecfromcloneRP5991C6onchromosome6q14sequence(AL07859919)aBl2850Humanmitochondriongenome(NC00180721)aCl850HumanDNAsequencefromclone75K24onchromosome6q13I(AL03570013)aC9550NomatchaCl0500NomatchaCll550Nomatcha

5、DI500HumanguanylinmRNA，completecds(M95174)aD3500’HnmanDNAsequencefrome[oncGSl27987onchromosomeIq2513ll(AL07864410)aD4700Humanbeta2syntrophinmRNA(NM_0067501)aE3450HumanmRNAfragmentcodingforhistocompatibilityantigenHLAl(V0

6、0528)aE4500HumanmRNAforKIAA0212gene(D869671)aGl一650NomatchaF9800’HomosapiensPACcloneRP5113lGl7from7p15Ip14(AC006022)a16600HomosapiensBRXmRNA(AFl2608)SubtractedT—NcDNALibrarybA9480HumanmRNAfragmentcodingfor545e153642052le