新城疫病毒F-,48-E-,9-和La Sota毒株F蛋白B細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位區(qū)段的鑒定和免疫原性比較.pdf

1、新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病。有研究表明用于禽類的ND疫苗并不能完全阻止該病的發(fā)生，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然我們對于造成免疫雞群發(fā)生新城疫流行的根本原因尚不明確，但流行毒株的變異很可能是其中的重要因素之一。本研究的目的就是探討流行毒和疫苗毒的抗原性差異及其與免疫保護(hù)的關(guān)系。 NDVF48E9株屬于我國特有基因型Ⅸ型，該型病毒在我國長期流行。LaSota是最為常用的疫苗株之一，有研究

2、發(fā)現(xiàn)二者在生物學(xué)、血清學(xué)和基因方面有一定的差異，因此，這兩個毒株是我們研究NDV流行機(jī)制的優(yōu)秀模型。為確定兩毒株的具體差異所在，本研究在應(yīng)用可及性、親水性和二級結(jié)構(gòu)等5種參數(shù)對新城疫我國特有標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9株與LaSota疫苗株F蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行綜合預(yù)測的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了表位的鑒定、篩選和比較研究，同時檢測了雞IL-18成熟肽蛋白作為多肽疫苗佐劑的免疫效果。 將兩毒株F基因預(yù)測表位，根據(jù)位置鄰近性合并成4段表位區(qū)，將F

3、48E9和LaSotaF基因的8個片段亞克隆并構(gòu)建到原核表達(dá)載體，分別對每個毒株的4個預(yù)測區(qū)段進(jìn)行表達(dá)。應(yīng)用建立的Tricine緩沖體系5％-20％線性梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳對表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明4段多肽的分子量分別是，P1：8.0KD、P2：10.8KD、P5：13.5KD、P6：10.5KD。表達(dá)的肽段主要以包涵體形式存在，我們用Ni-NTA成功純化制備了融合表達(dá)的重組多肽片段。應(yīng)用自制的NDVF48E9和LaSota特異性

4、抗血清，采用WesternBlot對所表達(dá)的P1、P2、P5、P6肽段進(jìn)行了抗原性鑒定。結(jié)果顯示：F48E9和LaSota株F蛋白4個表位肽段(P1：1-48aa；P2：55-126aa；P5：377-458aa；P6：469-530aa)均成陽性反應(yīng)，即都含有B細(xì)胞表位。比較發(fā)現(xiàn)F48E9P5(FP5)和LaSotaP5(LP5)與anti-F48E9和anti-LaSota血清反應(yīng)時存在強(qiáng)弱差異。 為了比較FP5和LP5的免

5、疫原性差異和了解是否具有中和性表位。我們將純化的FP5和LP5與雞IL-18成熟肽蛋白以不同組合免疫SPF雞，采集血清，用ELISA檢測不同免疫組的NDV特異性血清抗體效價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各免疫組均可刺激產(chǎn)生一定效價的NDV特異性抗體，有趣的是FP5與雞IL-18成熟肽蛋白聯(lián)合免疫組的抗體水平顯著高于LP5與雞IL-18成熟肽聯(lián)合免疫組以及FP5、LP5單獨免疫組；用NDVF48E9株攻毒結(jié)果顯示FP5與雞IL-18成熟肽蛋白聯(lián)合免疫具有20

6、％的保護(hù)率，而其他各組均未保護(hù)。說明兩個毒株的P5段均具有較好的免疫原性，但它們之間存在不同的中和表位，而LP5不能抵抗強(qiáng)毒的攻擊，證明強(qiáng)弱毒的這種差異造成兩個毒株之間的交叉保護(hù)性降低，提示我們NDV在免疫雞群中的流行很可能就是這種中和表位差異累積造成的；雞IL-18成熟肽蛋白在免疫后期階段明顯增強(qiáng)了F48E9P5和LaSotaP5多肽的免疫原性，說明雞IL-18成熟肽具有良好的佐劑活性，是一個有潛在應(yīng)用前景的分子免疫佐劑。本研究為ND