新城疫F48E9毒株和Lasota毒株感染雞胚成纖維細(xì)胞后部分細(xì)胞因子差異表達(dá)的研究.pdf

1、雞新城疫是由新城疫病毒引起的一種高度接觸性、毀滅性的傳染病，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)新城疫病毒感染雞的臨床癥狀，將其分為3類(lèi)，即速發(fā)型（強(qiáng)毒株）、中發(fā)型（中等毒力毒株）及緩發(fā)型（弱毒株），不同毒株的致病性不同。雞細(xì)胞因子是介導(dǎo)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞與細(xì)胞之間信號(hào)傳遞的重要可溶性介質(zhì)。雞細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和抗感染免疫中具有重要的作用。因此，為了更好的了解病原致病的潛在的過(guò)程和致病的分子機(jī)理，研究細(xì)胞因子的表達(dá)情況可以為復(fù)雜的免疫應(yīng)答

2、提供依據(jù)。本研究從細(xì)胞水平入手，以感染新城疫強(qiáng)、弱毒的雞胚成纖維細(xì)胞為模型，研究了9個(gè)細(xì)胞因子在雞胚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況，為病毒感染后細(xì)胞因子在雞胚成纖維細(xì)胞當(dāng)中生物學(xué)功能以及新城疫病毒感染的分子機(jī)理的研究提供依據(jù)。
　　 根據(jù)GenBank上雞干擾素-α(IFN-α)、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素2(IL-2)、白介素6（IL-6）、白介素10(1L-10)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)、白介素16

3、(IL-16)和白介素18(IL-18)基因的序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成各自特異引物，并以β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用SYBRGreenⅠ染料法，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。將基因克隆至pMD19-T載體上，以各陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果如下：雞IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-6，IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18和β-actin基因的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度在2×104～2×108co

4、pies/μL范圍分別呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997～1.000。熔解曲線(xiàn)分析表明，產(chǎn)物為特異的單峰，建立的雞IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16和IL-18基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)周期短，為在mRNA水平對(duì)雞細(xì)胞因子的定量分析奠定了基礎(chǔ)。
　　 用建立的Real-time PCR方法檢測(cè)NDVF48E9、Lasota毒株感染后0、4、8、1

5、2、24、36小時(shí)雞胚成纖維細(xì)胞中IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16和IL-18基因的差異表達(dá)情況如下：IL-15和IL-18在4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)F48E9感染組、Lasota感染組與對(duì)照組差異極顯著，表達(dá)量均顯著低矛對(duì)照組。而36小時(shí)F48E9感染組與對(duì)照組相比差異顯著，F(xiàn)48E9感染組細(xì)胞因子IL-15和IL-18表達(dá)量快速上升，高于對(duì)照組表達(dá)量；同時(shí)Lasot