Ⅰ型鴨肝炎病毒E53株在鴨胚成纖維細(xì)胞上的適應(yīng)性研究.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是雛鴨的一種高度致死性急性傳染病，以肝炎為主要特征，病原是鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)。我國流行的鴨肝炎以Ⅰ型DHV(DHV-Ⅰ)為主。預(yù)防本病的最有效的措施是疫苗接種，目前我國尚無商品化疫苗，用于預(yù)防DVH的疫苗主要是DHV雞胚化弱毒疫苗、DHV雞胚化滅活苗和DHV鴨胚化滅活苗。雞胚化和鴨胚化疫苗，相對(duì)于細(xì)胞苗而言，其操作繁瑣、產(chǎn)量低，因

2、此，將DHV適應(yīng)雞胚或鴨胚成纖維細(xì)胞，對(duì)于改進(jìn)DHV疫苗生產(chǎn)工藝，提高疫苗產(chǎn)量具有重要意義。
　　 本研究將DHV-E53雞胚致弱株適應(yīng)鴨胚成纖維細(xì)胞，連續(xù)傳代至第16代時(shí)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，第21代時(shí)細(xì)胞病變呈現(xiàn)規(guī)律性，接毒后72h細(xì)胞病變達(dá)到80％，其病變特征是細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞崩解死亡、脫落。通過RT-PCR對(duì)DHV-ED適應(yīng)株各代次進(jìn)行鑒定，均得到目的條帶，結(jié)果表明DHV-E53株能夠在鴨胚成纖維細(xì)胞上增殖。間接免疫熒光

3、法(IFA)鑒定，接種DHV-ED16株的鴨胚成纖維細(xì)胞有明顯的特異性綠色熒光，說明DHV-ED16株病毒能夠感染細(xì)胞。進(jìn)行適應(yīng)株遺傳特性分析，利用RT-PCR擴(kuò)增出DHV-ED16和DHV-ED30代的VP0、VP1及VP3基因，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn):DHV-ED16和DHV-ED30的VP1基因與參考序列之間核苷酸、氨基酸均無差異;而DHV-ED16和DHV-ED30的VP0、VP3基因與參考序列之間核苷酸、氨基酸的同源性均在99％以上。生

4、物學(xué)特性研究:適應(yīng)株DHV-ED16、DHV-ED21、DHV-ED26、DHV-ED30在鴨胚成纖維細(xì)胞上的TCID50分別為10-3.42/0.1 ml、10-3.86/0.1 ml、10-3.93/0.1ml、10-3.46/0.1 ml;將100TCID50DHV-ED16、DHV-ED21、DHV-ED26和DHV-ED30分別接種于鴨胚成纖維細(xì)胞，在不同時(shí)間收集病毒，測定病毒效價(jià)，繪制病毒生長曲線，結(jié)果表明DHV-ED16、

5、DHV-ED21、DHV-ED26及DHV-ED30均在72h左右病毒滴度達(dá)到高峰，隨著時(shí)間增長，病毒滴度增長緩慢，較為平穩(wěn);DHV-ED16株的雞胚ELD50為10-5.32/0.2mL（9日齡SPF雞胚），病變特點(diǎn)為胚胎發(fā)育不良，胚體較小，體表充血、出血，腹部水腫，并且肝臟有出血斑點(diǎn)及細(xì)小壞死灶;DHV-ED16株的鴨胚ELD50為10-4.78/0.2mL（9日齡SPF鴨胚）,病變特點(diǎn)與雞胚相似，為鴨胚胎發(fā)育不良，胚體較小，體表大