沉默食管癌EC9706細(xì)胞CD147表達(dá)的初步研究.pdf

1、背景和目的：CD147是于1982年發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族的一員。最初人們認(rèn)為CD147是一種能夠誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶在成纖維細(xì)胞中表達(dá)的腫瘤表面蛋白,這種蛋白最初被命名為腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的膠原酶啟動因子(tumor cell collagenasestimulatory factor,TCSF)。隨著它的純系化,TCSF確定為一種與免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF)的蛋白質(zhì)有高度的同源性的跨膜

2、糖蛋白,并且能夠誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的產(chǎn)生。研究表明CD147在多種腫瘤中高表達(dá),并且與腫瘤的侵潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但是它的表達(dá)不僅局限于腫瘤細(xì)胞。CD147是一種多效分子,CD147對于胎兒的發(fā)育和視網(wǎng)膜的功能起著至關(guān)重要的作用,并且已經(jīng)被證實在胸腺T細(xì)胞的發(fā)育過程中起作用。由于它表達(dá)的廣泛性和分子的多效性,研究CD147蛋白與蛋白之間的相互作用及其調(diào)控對腫瘤干預(yù)治療策略是十分重要

3、的。因此,本實驗擬構(gòu)建針對CD147基因的siRNA表達(dá)載體,脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染入人食管癌細(xì)胞株EC9706,檢測該細(xì)胞中CD147基因表達(dá)的沉默效果,初步觀察分析CD147基因表達(dá)沉默對食管癌EC9706細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　實驗方法：利用promega siRNA靶序列分析設(shè)計系統(tǒng),掃描人CD147 cDNA編碼序列(NM001728),依據(jù)siRNA靶序列設(shè)計原則,并且經(jīng)BLAST同源性分析,選擇確定3個針對CD147的

4、siRNA靶序列。分別合成3對靶向CD147 siRNA序列的發(fā)卡樣DNA單鏈,退火成雙鏈DNA,重組入siRNA表達(dá)載體pGeneClip中;利用PstⅠ酶切篩選鑒定重組子pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203;以M13+/M13-為引物對重組子的插入序列進(jìn)行DNA序列分析。利用脂質(zhì)體包裹將siRNA表達(dá)載體pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGe

5、neClip-si1203轉(zhuǎn)入人食管癌EC9706細(xì)胞中,同時設(shè)空載體對照組(轉(zhuǎn)染空載體pGeneClip)和空白對照組(未轉(zhuǎn)染);熒光定量RT-PCR方法和Western-Blot檢測各組細(xì)胞CD147mRNA和蛋白表達(dá)水平;ELISA方法檢測各組細(xì)胞的MMP-9水平;流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞侵襲實驗(Matrigel Invasion Assay)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期和侵襲轉(zhuǎn)移情況。
　　實驗結(jié)果：1.初步篩選得到14個候選siRN

6、A靶區(qū)段,經(jīng)過同源序列檢索和進(jìn)一步優(yōu)選,最終確定257-275位(GATCCAGTGGTGGTTTGAA)、943-961位(GGTCAGAGCTACACATTGA)和1203-1221位(GGGCAGCACCAGAATGACA)為靶序列區(qū)段。2.siRNA發(fā)卡DNA的退火后三個退火產(chǎn)物si257、si943和si1203,電泳可見三條明亮條帶,位于近100bp處,與設(shè)計一致。3.PstⅠ酶切篩選得到重組子pGeneClip-si257

7、、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203,測序分析其插入序列與設(shè)計完全一致。4.實驗組(pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203)的EC9706細(xì)胞,CD147基因的mRNA表達(dá)水平明顯降低,與兩個對照組(空載體對照組和空白對照組)比較,差異有顯著性(P<0.05);其中pGeneClip-si1203的沉默抑制作用最強(qiáng)。5.空白對照組和空載體對照組在約為

8、60kD均有明顯印跡條帶,而3個實驗組的印跡條帶都明顯弱于空白對照組和空載體對照組;其中以實驗3組(轉(zhuǎn)染pGeneClip-si1203)的印跡條帶最淺。與熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果一致。6.實驗1、2、3組、空載體對照組、空白對照組之間G0~G1期、G2~M期、S期比例及細(xì)胞增殖率的差異無顯著性(P>0.05)。7.兩個對照組(空載體對照組和空白對照組)MMP-9含量差異無顯著性(P>0.05):與3個實驗組比較差異均有顯著性(P>

9、0.05)。說明抑制食管癌EC9706細(xì)胞CD147的表達(dá)可抑制細(xì)胞MMP-9的產(chǎn)生。8.實驗1、2、3組細(xì)胞與空載體對照組、空白對照組相比穿透人工基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少,異性有顯著差異(P<0.05)。實驗3組(轉(zhuǎn)染pGeneClip-si1203)的抑制穿透人工基底膜作用強(qiáng)于實驗2組和實驗1組。
　　結(jié)論：1.CD147基因1203-1221位(GGGCAGCACCAGAATGACA)是有效沉默表達(dá)的siRNA靶序列,構(gòu)建的s