茶尺蠖化學(xué)感受相關(guān)基因的克隆與功能研究.pdf

1、選擇適宜的產(chǎn)卵地對于鱗翅目昆蟲的種群延續(xù)尤為重要，因?yàn)樗鼈兊某醴跤紫x個(gè)體小、運(yùn)動能力差很難再更換寄主植物。昆蟲的寄主選擇行為是一個(gè)連續(xù)的過程，包括搜索、降落、接觸評價(jià)和最終的決定。寄主植物的揮發(fā)物和植物組織內(nèi)的次生代謝物對于昆蟲的寄主定位和產(chǎn)卵地的選擇至關(guān)重要。一般來說，昆蟲通過其靈敏的嗅覺系統(tǒng)在遠(yuǎn)距離上感受寄主植物的揮發(fā)物進(jìn)行定位，而接下來對寄主植物組織內(nèi)的非揮發(fā)性次生代謝物的接觸評價(jià)則涉及到味覺識別過程。觸角是昆蟲主要的嗅覺器官，上

2、面分布的各類感受器使昆蟲能夠靈敏的感知到外界的信息化合物。茶尺蠖屬于鱗翅目尺蠖蛾科，是我國茶樹的主要害蟲之一，以幼蟲食葉為害，嚴(yán)重影響茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量。化學(xué)方法防治茶尺蠖簡單有效，但會威脅食品安全，破壞生態(tài)環(huán)境。其它的方法如“推-拉”策略、人工合成性信息素等基于昆蟲寄主選擇機(jī)制的行為調(diào)控方法已得到了研發(fā)。茶尺蠖單一的取食幾種植物，因此選擇適宜的寄主植物需要精確的感覺系統(tǒng)來完成。此外有研究證明，茶尺蠖取食會誘導(dǎo)茶樹釋放大量的揮發(fā)物，并吸引其

3、雌蛾前來產(chǎn)卵。目前對茶尺蠖與其寄主茶樹之間化學(xué)通訊的研究尚不完善，由于缺乏對茶尺蠖寄主選擇機(jī)制的知識給防治造成了被動。深入研究茶尺蠖與其寄主茶樹的化學(xué)通訊機(jī)制，闡明氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)受體的生理功能，有助于發(fā)掘更具有潛力的害蟲靶標(biāo)基因，便于設(shè)計(jì)更合理的昆蟲行為調(diào)控劑服務(wù)于茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本文通過分子生物學(xué)的相關(guān)技術(shù)，對茶尺蠖的氣味結(jié)合蛋白、化學(xué)感受蛋白以及化學(xué)受體進(jìn)行初步研究。利用電子顯微鏡觀察了成蟲雌雄觸角和前足跗節(jié)與寄主定位相關(guān)的各類感器

4、的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果如下：1.茶尺蠖成蟲觸角和足跗節(jié)的感器掃描及超微結(jié)構(gòu)觀察
　　為了研究各類感器在茶尺蠖寄主定位中的功能，通過掃描電鏡觀察茶尺蠖雌雄蛾觸角和雌蛾前足跗節(jié)的化學(xué)感受器的外部形態(tài)，利用透射電鏡觀察感器內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)。共鑒定出8種感器(包括15個(gè)亞型)。在成蟲觸角上，毛形感器分為兩個(gè)亞型，是數(shù)量最多的一類感器，表皮較厚，氣孔數(shù)目少，感器淋巴液存在神經(jīng)元樹突。刺形感器分為三個(gè)亞型，表皮壁較厚，沒有氣孔結(jié)構(gòu)，頂部有單孔，感器淋

5、巴液內(nèi)腔中有樹突神經(jīng)元。錐形感器(包含三個(gè)亞型)和耳形感器表皮壁比較薄，分布著大量的氣孔，感器淋巴液分布大量的樹突神經(jīng)元。栓錐形感器表皮壁較厚，無孔道結(jié)構(gòu)，具有2~3個(gè)樹突神經(jīng)元。腔錐形感器屬于雙壁型感受器，具有4-7個(gè)樹突神經(jīng)元。同時(shí)在觸角上也觀察到鱗形感器和B?hm氏鬃毛的存在。在雌蛾前足第5跗節(jié)上觀察到兩類刺形感器存在，構(gòu)成了主要化學(xué)感受器，推斷刺形感器具有味覺感知的功能。參考之前其它昆蟲上的有功能報(bào)道的同類型感器，比較推斷茶尺蠖

6、中相關(guān)感器的功能，為以后系統(tǒng)研究感器的功能做準(zhǔn)備。
　　2.茶尺蠖成蟲足轉(zhuǎn)錄組測序分析與寄主定位相關(guān)基因鑒定
　　感受寄主植物表面非揮發(fā)性次生代謝物涉及到味覺感受決定了寄主選擇的偏好，茶尺蠖前足跗節(jié)分布有的化學(xué)感受器。對茶尺蠖雌雄成蟲足的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行HiSeq2500測序，通過生物信息學(xué)分析和同源比對的方法，鑒定出化學(xué)感受的相關(guān)基因包括24個(gè)OBPs、21個(gè)CSPs、2個(gè)SNMPs、3個(gè)GRs、4個(gè)ORs。RPKM值量化基因表

7、達(dá)豐度發(fā)現(xiàn)，EoblOBP6在雌雄轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)量均最高，9個(gè)EoblOBPs在雌雄足表達(dá)存在顯著差異，8個(gè)EoblOBPs在雌蛾足中上調(diào)，只有1個(gè)EoblOBPs在雄蛾足發(fā)生上調(diào)，這些雌蛾足中高表達(dá)的基因暗示了雌蛾對于搜尋產(chǎn)卵地的生態(tài)適應(yīng)性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，茶尺蠖的 EoblGR2與糖受體 HarmGR4序列同源性很高(相似度76％)，推斷EoblGR2是果糖受體。通過半定量RT-PCR和熒光定量qRT-PCR分析這些基因的組織表達(dá)

8、：
　　(1)大部分的EoblOBPs在觸角有表達(dá)。其中16個(gè)EoblOBPs在成蟲觸角特異性表達(dá)，此外有3個(gè)EoblOBPs在成蟲足部高表達(dá)，EoblOBP7主要存在于腹部。其余5個(gè)EoblOBPs各組織分布比較廣泛，EoblOBP5、EoblOBP6、EoblOBP22主要在成蟲足和觸角有表達(dá)。在觸角中高表達(dá)的 OBP可能參與性信息素識別、寄主植物定位和搜尋適宜產(chǎn)卵地的過程，而在足和腹部高表達(dá)的OBP功能還有待研究。
　

9、　(2)21個(gè)EoblCSPs組織表達(dá)分布廣泛，其中6個(gè)EoblCSPs主要在足中表達(dá)，其中EoblCSP11和EoblCSP15在雄蟲的足特異性表達(dá)。EoblCSP2、EoblCSP10和EoblCSP16主要在成蟲腹部表達(dá)。EoblCSP6在觸角特異表達(dá)，EoblCSP6和EoblCSP9主要在觸角表達(dá)，推斷在嗅覺識別過程中發(fā)揮作用。除此之外，EoblCSP1、EoblCSP3、EoblCSP4、EoblCSP9、EoblCSP12

10、、EoblCSP13、EoblCSP14、EoblCSP17、EoblCSP19和EoblCSP20在成蟲足部都有較高的表達(dá)量。在足部高表達(dá)或者特異表達(dá)的CSP可能參與味覺物質(zhì)的識別。
　　(3) EoblSNMP1和EoblSNMP2在觸角中表達(dá)量顯著高于其它組織。4個(gè)EoblORs也主要在觸角表達(dá)。在鑒定出的3個(gè)EoblGRs中，EoblGR1主要在腹部表達(dá)而EoblGR2在觸角高表達(dá)， EoblGR3主要在足表達(dá)。
　

11、　3. EoblOBP3和EoblOBP6的結(jié)合特性分析
　　選擇在成蟲足轉(zhuǎn)錄組高豐度EoblOBP3和EoblOBP6作為研究對象，通過熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)測定了EoblOBP3和EoblOBP6與10種茶樹揮發(fā)物、8種害蟲誘導(dǎo)茶樹釋放揮發(fā)物、16種非生境植物揮發(fā)物、18種味覺物質(zhì)的結(jié)合能力。結(jié)果顯示：
　　(1) EoblOBP3與順-馬鞭草烯醇結(jié)合能力最強(qiáng)，其對茶尺蠖成蟲有顯著的驅(qū)避作用。EoblOBP3能夠結(jié)合(Z)-己

12、酸-3-己烯酯，此種揮發(fā)物為茶樹受到害蟲取食后產(chǎn)生，顯著吸引雌蛾。EoblOBP3還結(jié)合茶樹的揮發(fā)物癸醛。EoblOBP3結(jié)合α-法尼烯，由害蟲為害后誘發(fā)的一種揮發(fā)物。EoblOBP3還能夠結(jié)合味覺物質(zhì)槲皮素，這類物質(zhì)為具有苦味的生物堿，對昆蟲有拒食作用。
　　(2) EoblOBP6與橙花叔醇和α-法尼烯的結(jié)合能力最強(qiáng)，這兩類物質(zhì)在是害蟲取食茶樹后誘導(dǎo)產(chǎn)生。EoblOBP6還能夠結(jié)合苯甲醛，此類物質(zhì)為茶梢的揮發(fā)物成分之一。Eob

13、lOBP6可以結(jié)合萜烯類物質(zhì)α-松油烯和α-石竹烯。此外，EoblOBP6和硫酸黃連素有很強(qiáng)的的結(jié)合能力，這種物質(zhì)為生物堿具有苦味，對昆蟲有強(qiáng)烈的拒食作用。EoblOBP6和 EoblOBP3均不結(jié)合糖類物質(zhì)和氨基酸類化合物。利用膠體金免疫組織定位發(fā)現(xiàn)EoblOBP6在觸角和雌蛾前足跗節(jié)的刺形感器淋巴液外腔中表達(dá)。
　　4.嗅覺受體基因的鑒定與組織表達(dá)分析
　　對茶尺蠖雌雄成蟲觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定出27個(gè)嗅覺受體基因。