鞘內(nèi)注射利多卡因?qū)Υ笫笊窠?jīng)病理性疼痛的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分：鞘內(nèi)注射利多卡因?qū)β宰巧窠?jīng)壓迫模型大鼠神經(jīng)病理性疼痛的治療作用 目的：采取主動(dòng)性鞘內(nèi)注射大劑量的利多卡因，可治愈頑固性、難治性疼痛。但目前，此方法仍存在很多尚未明確的問題，如治療時(shí)藥物的最佳劑量，其療效維持時(shí)間等。本課題擬應(yīng)用慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷大鼠模型(Chronicconstrictioninjury，CCI)，比較不同劑量利多卡因?qū)β詨浩刃該p傷模型大鼠的熱痛敏和觸覺異常疼痛的作用

2、，確定有效藥物劑量范圍，治療后的療效及疼痛緩解時(shí)間，探討鞘內(nèi)注射利多卡因療法的最佳模式和治療效應(yīng)，為其在臨床上的安全應(yīng)用提供參考. 方法：健康清潔級成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為10組：其中8組大鼠均接受CCI手術(shù)，在CCI手術(shù)后7天，分別接受鞘內(nèi)注射0.9％生理鹽水(saline組)，或不同濃度的利多卡因注射組(2，4，6.5，10，15，25，和35mg/kg)。正常組和正常對照組不行CCI手術(shù)，其中一組接受鞘內(nèi)25mg/kg利

3、多卡因注射。觀察各組術(shù)前(baseline)，CCI術(shù)后(CCI1天，3天，6天)，鞘內(nèi)注射利多卡因(Singleintrathecallidocaine，SIL)1天，2天...10天的觸覺縮爪閾值(VonFreywithdrawalthreshold，PWT)和熱潛伏縮爪閾值(ThermalPawWithdrawallatency，PWL)改變。正常組和正常對照組行FJB染色。術(shù)中記錄其血壓、心率、呼吸等指標(biāo)的變化。 結(jié)果：

4、大鼠CCI術(shù)后6天PWT和PWL明顯下降，接受鞘內(nèi)注射利多卡因后，6.5mg-35mg組熱痛敏異常明顯緩解，并呈現(xiàn)劑量相關(guān)，可持續(xù)2-8天，但是2mg和4mg組沒有明顯效果。15，25，35mg/kg組可以明顯減輕CCI大鼠的觸覺異常疼痛。正常組和正常對照組的PWT和PWL以及FJB染色沒有差異。 結(jié)論：鞘內(nèi)注射利多卡因可以明顯抑制大鼠由CCI手術(shù)所引起的神經(jīng)痛，考慮到利多卡因的有效性以及不良反應(yīng)，最佳有效劑量應(yīng)為15-25mg

5、/kg。 第二部分：抑制小膠質(zhì)細(xì)胞p38MAPK磷酸化是鞘內(nèi)注射利多卡因治療CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛的重要機(jī)制 目的：第一部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射15-25mg/kg利多卡因可以明顯抑制大鼠CCI手術(shù)所引起的神經(jīng)痛，但其機(jī)制尚不明確。目前，在多種疼痛模型上發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)損傷后脊髓的小膠質(zhì)細(xì)胞磷酸化p38有絲分裂原激活蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase；p38MAPK)免疫反應(yīng)陽性成分明

6、顯增加，而鞘內(nèi)給予p38MAPK抑制劑可以減輕傷害感受性行為學(xué)變化。這些研究均提示了脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞p38MAPK在痛覺過敏的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。本研究應(yīng)用免疫熒光和蛋白免疫印跡技術(shù)法研究鞘內(nèi)注射利多卡因與脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的p38MAPK信號通路之間的關(guān)系。 方法：健康清潔級成年雄性SD大鼠.隨機(jī)分為4組：Norm組(正常大鼠)，CCⅠ組(單純行CCI神經(jīng)痛手術(shù))，CCI+0.9％NaCl組(CCI后7天，鞘內(nèi)注射0.5ml0.

7、9％NaCl)，CCI+25mg/kg利多卡因組(CCI后7天，鞘內(nèi)注射0.5ml25mg/kg利多卡因).①對CCI神經(jīng)痛模型大鼠LA-5脊髓冰凍切片行免疫熒光染色，將磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)抗體與小膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物OX42抗體，或神經(jīng)元特異標(biāo)記物NeuN抗體，或星型膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物GFAP抗體共標(biāo)，觀察p-p38MAPK在CCI神經(jīng)痛模型的大鼠脊髓各種細(xì)胞上的表達(dá)情況。應(yīng)用蛋白免疫印跡技術(shù)，觀察CCI術(shù)后大鼠L

8、4-5脊髓p-p38MAPK蛋白表達(dá)的變化。②鞘內(nèi)注射利多卡因術(shù)后4天，用免疫熒光染色方法和蛋白免疫印跡技術(shù)觀察各組大鼠p-p38MAPK蛋白表達(dá)情況. 結(jié)果：①CCI神經(jīng)痛模型可引起大鼠L4-5脊髓p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增加；p-p38MAPK抗體與小膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物OX42，神經(jīng)元特異標(biāo)記物NeuN，或星型膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物GFAP共標(biāo)結(jié)果顯示，p-p38MAPK和OX42共定位良好，說明坐骨神經(jīng)壓迫性損傷手術(shù)引起

9、L4-5脊髓p-p38MAPK蛋白特異地表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞。②免疫熒光法和蛋白免疫印跡技術(shù)法均證明鞘內(nèi)注射25mg/Kg利多卡因可明顯抑制大鼠L4-5脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞上p-p38MAPK表達(dá)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，在CCI手術(shù)后，大鼠L4-5脊髓的p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增加，p-p38MAPK僅特異地表達(dá)于脊髓的小膠質(zhì)細(xì)胞上。鞘內(nèi)注射利多卡因25mg/kg可以明顯抑制大鼠CCI神經(jīng)痛模型所引起的觸覺異常疼痛，部分機(jī)制可能是

10、由于抑制了L4-5脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞p-p38MAPK表達(dá)。 第三部分利多卡因抑制ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α，IL-1β和IL-6 目的：第二部分研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的p38MAPK在CCI神經(jīng)損傷模型導(dǎo)致的神經(jīng)痛中扮演重要的角色。而鞘內(nèi)注射利多卡因可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p38MAPK的激活。本研究應(yīng)用ELISA，蛋白免疫印跡技術(shù)法和RealtimePCR等方法研究利多卡因?qū)TP誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)

11、鈣離子，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)的影響，并了解其和小膠質(zhì)細(xì)胞的p38MAPK信號通路之間的關(guān)系。 方法：原代培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為5組：Control組，1mMATP組，1mMATP+0.1mMLidocaine組，1mMATP+1mMLidocaine組，1mMATP+10mMLidocaine組。①用蛋白免疫印跡技術(shù)法觀察，不同濃度利多卡因?qū)?mMATP誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)

12、的小膠質(zhì)細(xì)胞p-p38MAPK的表達(dá)情況。②用RealtimePCR的方法，觀察不同濃度利多卡因?qū)?mMATP誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TNF-α，IL-1β和IL-6mRNA水平變化情況。③用ELISA方法觀察不同濃度利多卡因?qū)?mMATP誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TNF-α，IL-1β和IL-6蛋白水平變化情況。④用單細(xì)胞鈣成像法觀察不同濃度利多卡因?qū)?mMATP誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣變化的影響。⑤用MTT方法了解不同濃

13、度利多卡因?qū)υ囵B(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞活力影響。 結(jié)果：①蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10mM利多卡因可明顯抑制1mMATP誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞p-p38MAPK的表達(dá)(P＜0.05)。②RealtimePCR結(jié)果顯示利多卡因可明顯抑制1mMATP誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TNF-α，IL-1β和IL-6mRNA水平，呈濃度依賴性，10mM利多卡因最為明顯(分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)。③ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)利

14、多卡因可明顯抑制1mMATP誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TNF-α，IL-1β和IL-6蛋白水平表達(dá)，呈濃度依賴性，10mM利多卡因最為明顯(分別為P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)。④單細(xì)胞鈣成像結(jié)果顯示10mM利多卡因可以明顯抑制對1mMATP誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣增加(P＜0.05)。⑤MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)濃度的利多卡因?qū)υ囵B(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞活力無影響. 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利多卡因可以抑制ATP誘導(dǎo)的大