人源抗hTLR4基因工程抗體Fab片段的制備及生物特性鑒定.pdf

1、研究目的：TLR4受體是一種模式識(shí)別受體，在對TLR4的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR4在LPS介導(dǎo)的嚴(yán)重反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。TLR4通過依賴MyD88途徑或不依賴MyD88途徑調(diào)節(jié)LPS在細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，從而控制內(nèi)毒素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。阻斷TLR4介導(dǎo)的內(nèi)毒素信號向細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)，是減輕內(nèi)毒素生物學(xué)效應(yīng)的有效的方法。本課題在上一階段的研究中成功制備出了鼠抗人TLR4單克隆抗體，體外活性檢測顯示其能顯著抑制經(jīng)LPS刺激TNF-α的產(chǎn)生。但鼠源單

2、克隆抗體在人體治療中易出現(xiàn)人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)。嵌合抗體技術(shù)是將人源抗體恒定區(qū)替代鼠抗體的恒定區(qū)，構(gòu)建人鼠嵌合抗體，不僅可以保留親本抗體的高親和力，而且大大降低鼠單克隆抗體在人體應(yīng)用中的免疫原性。本研究在嵌合抗體技術(shù)的基礎(chǔ)上，針對人源抗TLR4抗體設(shè)計(jì)合成抗TLR4抗體Fab片段基因，利用重疊延伸法擴(kuò)增Fab片段基因，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，探索其原核表達(dá)，以期獲得有效的抗TLR4抗體Fab片段。
　　研究方法：

3、　　1.制備人源抗TLR4抗體Fab片段利用PCR技術(shù)從本課題上一階段篩選的陽性噬菌體中擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL基因，采用重疊擴(kuò)展延伸法成功將人源抗體恒定區(qū)重鏈與輕鏈分別與噬菌體擴(kuò)增的可變區(qū)重鏈和輕鏈拼接，獲得重組重鏈Fd和輕鏈；進(jìn)一步構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuetTM-1-Fab；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)，獲得高純度的人源抗TLR4抗體Fab片段。
　　2.鑒定Fab抗體與抗原的相互作用及測定抗體親和常數(shù)采用流式細(xì)

4、胞儀及BiacoreX100儀分別檢測抗TLR4抗體 Fab片段特異性識(shí)別TLR4抗原的能力及抗體的親和力。
　　3.抗體體外中和試驗(yàn)體外中和實(shí)驗(yàn)檢測抗TLR4抗體Fab片段對炎癥因子TNF-α的中和作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功擴(kuò)增獲得重組重鏈Fd和輕鏈DNA片段；構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pETDuetT-1-Fab；轉(zhuǎn)入大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后，親和純化獲得高純度的抗TLR4抗體Fab片段。
　　2. ELISA

5、及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，本研究中所制備的抗體能夠與hTLR4特異性結(jié)合。
　　3.本研究中所制備的抗TLR4抗體Fab片段親和常數(shù)為1.619*10-7。
　　4.人源抗TLR4抗體Fab片段在體外可有效的保護(hù)細(xì)胞，中和腫瘤壞死因子TNF-α。
　　結(jié)論：
　　本研究成功制備人源抗TLR4抗體Fab片段，該抗體可與hTLR4特異性結(jié)合，親和力較高，在體外可有效中和腫瘤壞死因子TNF-α，保護(hù)細(xì)胞。表明通過基因工