人源性抗角蛋白單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)和Fab片段生物學(xué)作用及其分子機(jī)理的研究.pdf

1、第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文人源性抗角蛋白單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)和Fab片段生物學(xué)作用及其分子機(jī)理的研究姓名：李承新申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：皮膚病與性病學(xué)指導(dǎo)教師：劉玉峰2001.6.1第四軍醫(yī)大掌博士掌位論文!諸多限制，而且，由于角蛋白是分子量在48～68KD之間的一組分子，我們自正常人血清中所提取純化的AKautoAb也是針對這一組分子量不同的角蛋白的多克隆抗體，這就使研究中的AKautoAb作用特異性較差，無法明確AKautoAb的作用

2、究竟是源于針對某一特定角蛋白抗體的單獨(dú)作用，還是多種抗角蛋白抗體的綜合作用。因此，既往所觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少應(yīng)該是針對多種分子量角蛋白的綜合作用，尚無法反映針對不同分子量角蛋白的單克隆AKautoAb的作用。目前AKautoAb的研究正面臨兩大問題：①臨床應(yīng)用：研制具有良好療效、能批量生產(chǎn)且無毒副作用的產(chǎn)品，因此研發(fā)有效的抗角蛋白的基因工程抗體已是勢在必行；②作用機(jī)理：在分子水平上闡明AKautoAb生物學(xué)作用的細(xì)胞與分子機(jī)理，特別是A

3、KautoAb發(fā)揮作用的信號傳導(dǎo)機(jī)制，后者是全面闡明AKautoAb生物學(xué)作用的基礎(chǔ)。分子機(jī)理的研究是臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)，而臨床應(yīng)用又是闡明機(jī)理的目的。尋找更為有效和準(zhǔn)確的研究方法及手段來盡快解決這些問題已迫在眉睫。我們進(jìn)行取研究的目的就在于觀察抗角蛋白基因工程抗體Fab片段的生物學(xué)效應(yīng)、制備抗角蛋白基因工程單鏈抗體及探討抗不同分子量角蛋白的抗體生物學(xué)作用的、可能的信號傳導(dǎo)機(jī)制，為今后的深入研究奠定基礎(chǔ)。主碉實(shí)驗(yàn)內(nèi)容吸結(jié)果：＼／＼／第一部分

4、人源性抗角蛋白單鏈抗體的克隆、表達(dá)及活性測定1利用基因重組技術(shù)對從半合成噬菌體抗體庫中克隆的人源性抗角蛋白抗體Fab片段進(jìn)行了改造，獲得了人源性抗角蛋白SeFv片段。fDNA序列分析結(jié)果表明，pScFv的VK和VH基因序列同RRKZ的VK和Vn基因序列完全相同，表明在Fab片段改建成ScFv過程中未發(fā)生基因突變。用ELISA的方法測定可溶性表達(dá)的ScFv抗體與角蛋白以及鐵蛋白、胃蛋白酶、HBsAg等無關(guān)抗原的結(jié)合反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)ScFv能特異

5、性地與角蛋白結(jié)合而與其它抗原不結(jié)合，說明人源性抗角蛋白Fab抗體改建為ScFv后具有較好的特異性和親和力，但可溶性表達(dá)的ScFv的親和力低于可溶性Fab片段；0、2將利用噬菌體抗體庫技術(shù)從半合成噬菌體抗體庫中克隆到的人源性抗角蛋白抗體Fab片段成功地進(jìn)行了可溶性表達(dá)。(表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)金屬鏊合層析純化后，并采用ELISA和Westernblot等方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，可溶性表達(dá)的Fab片段不僅具有良好的抗原結(jié)合活性，而且，具有相當(dāng)高的特異性