溶血磷脂酶Sj1539蛋白在日本血吸蟲病免疫學(xué)診斷中的初步應(yīng)用.pdf

1、目的:尋找日本血吸蟲病新的免疫學(xué)診斷候選分子,從日本血吸蟲成蟲cDNA中擴(kuò)增出溶血磷脂酶Sj1539基因,亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中高效表達(dá)并提取重組抗原,重組抗原采用間接ELISA方法(Sj1539-ELISA)進(jìn)行日本血吸蟲病免疫學(xué)診斷。
　　方法:提取日本血吸蟲成蟲總RNA,反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,合成引物后PCR法擴(kuò)增出Sj1539編碼基因,與克隆載體pGEM-T連接,亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28a,經(jīng)酶切、測(cè)序

2、證實(shí)正確后,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),通過親和層析分離純化得到MW為25KD的重組Sj1539蛋白,SDS-PAGE和Westernblot驗(yàn)證表達(dá)量和免疫活性。將純化Sj1539蛋白和SjAWA包被反應(yīng)板,確定最適抗原包被量和血清稀釋度,采用Sj1539-ELISA、SjAWA-ELISA和SEA-IHA方法平行檢測(cè)55份急性、29份慢性和30份晚期血吸蟲病患者血清,36份其他寄生蟲病患者血清(22份華支睪吸蟲病患者血清,1

3、4份鉤蟲病患者血清)以及30份正常對(duì)照者血清,比較幾種方法之間特異性、敏感性以及交叉反應(yīng)性。
　　結(jié)果:PCR法擴(kuò)增出一條大小約為684bp的目的DNA片斷,將其亞克隆原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a,誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)SDS-PAGE可見一條約25KDa大小的蛋白條帶。親和層析法純化Sj1539樣蛋白,經(jīng)Western-blot驗(yàn)證目的蛋白Sj1539能夠與特異性抗體進(jìn)行反應(yīng)。使用該蛋白作為抗原進(jìn)行ELISA、與SjAWA-ELISA和S

4、EA-IHA方法平行檢測(cè)急、慢性和晚期血吸蟲病患者,華支睪吸蟲病患者、鉤蟲病患者和正常對(duì)照者血清,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Sj1539-ELISA和SjAWA-ELISA,對(duì)于上述55份急性血吸蟲病患者血清檢測(cè)的敏感性分別為89.0％和92.7%,經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)無顯著性差異(χ2=0.44,p>0.05);對(duì)于29份慢性血吸蟲病患者血清,Sj1539-ELISA和SjAWA-ELISA檢測(cè)的敏感性分別為65.5%和55.2%,經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)無顯著

5、性差異(χ2=0.65,p>0.05);對(duì)于30份晚期血吸蟲病患者血清,Sj1539-ELISA和SjAWA-ELISA檢測(cè)的敏感性分別為86.7%和80.0%,經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)無顯著性差異(χ2=0.48,p>0.05);對(duì)于30份正常人血清,兩種檢測(cè)方法的假陽(yáng)性率分別為3.3%和3.3%,無差異;對(duì)于36份其他寄生蟲病患者血清(華支睪吸蟲病患者血清22份,鉤蟲病患者血清14份),Sj1539-ELISA和SjAWA-ELISA檢測(cè)的血

6、清抗體的陽(yáng)性率分別為8.3%和13.9%,經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)無顯著性差異(χ2=0.14,p>0.05)。Sj1539-ELISA和SEA-IHA,對(duì)于55份急性血吸蟲病患者血清檢測(cè)的敏感性分別為89.0%和96.4%,經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)無顯著性差異(χ2=1.21,p>0.05);對(duì)于29份慢性血吸蟲病患者血清,Sj1539-ELISA和SEA-IHA檢測(cè)的敏感性分別為65.5%和69.0%,經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)無顯著性差異(χ2=0.08,p>0

7、.05);對(duì)于30份晚期血吸蟲病患者血清,Sj1539-ELISA和SEA-IHA檢測(cè)的敏感性分別為86.7%和86.7%,無差異;對(duì)于30份正常人血清,兩種檢測(cè)方法的假陽(yáng)性率分別為3.30%和0.00%,經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)無顯著性差異(χ2=1.02,p>0.05);對(duì)于36份其他寄生蟲病患者血清(華支睪吸蟲病患者血清22份,鉤蟲病患者血清14份),Sj1539-ELISA和SEA-IHA檢測(cè)的血清抗體的陽(yáng)性率分別為8.3%和2.8%,經(jīng)

8、校正χ2檢驗(yàn)無顯著性差異(χ2=0.26,p>0.05)。在本實(shí)驗(yàn)中Sj1539-ELISA法假陽(yáng)性率略高于SEA-IHA法,交叉反應(yīng)低于SjAWA-ELISA法,在診斷急、慢性和晚期血吸蟲病中與SjAWA-ELISA和SEA-IHA法有著相似的敏感性、特異性。本法操作簡(jiǎn)便,易于標(biāo)準(zhǔn)化。本研究Sj1539樣蛋白在診斷中的交叉反應(yīng)較少,表明Sj1539樣蛋白在血吸蟲病免疫診斷上具有較大的應(yīng)用潛能。
　　結(jié)論:本研究擴(kuò)增克隆日本血吸蟲