新城疫病毒分離株F基因的序列分析及F-,48-E-,9-株和La Sota株F基因的真核表達.pdf

1、本試驗利用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分別擴增出NDV青海株(QH3)、黑龍江株(HLJ)和甘肅株(A4)的融合蛋白基因的全長核苷酸，再克隆到pMD18-T載體中。經(jīng)酶切和質粒PCR鑒定，證明獲得陽性重組質粒后，進行序列測定并推導出其氨基酸序列，同時進行了分析和比較。序列分析結果表明，所獲得的3株分離株F基因完整的開放閱讀框長度為1662bp，共編碼F蛋白的553個氨基酸；QH3、HLJ和A4株均有相同的6個潛在的糖基化位點，

2、其F基因的裂解位點為112R-R-Q-K/R-R-F117，符合強毒株裂解區(qū)氨基酸組成的特征，且與MDT和ICPI的測定結果相吻合。 根據(jù)122株國內(nèi)外NDVF基因1～374bp的核苷酸序列繪制系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)：QH3株NDV為基因Ⅷ型；A4株NDV為基因Ⅵ型；HLJ株NDV為基因Ⅸ型。表明我國NDV流行毒株在各地區(qū)之間具有明顯的基因型差異，而且還具有不同于國外流行的我國特有的基因型——基因Ⅸ型。通過對NDVF基因核苷酸序列同

3、源性比較及遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)：我國不同年代、不同地區(qū)分離的NDV毒株與疫苗毒株之間在基因水平上存在較大差異，這種差異對氨基酸及蛋白質的結構和功能可能會有一定影響，而NDVF蛋白的差異同時也造成免疫原性的差異，這很可能是新城疫的免疫防治十分困難的原因之一。為了具體分析流行毒株和疫苗毒株之間的免疫原性差異情況和建立適用于檢測ND免疫和流行情況的方法，我們又分別表達了弱毒疫苗株LaSota和標準強毒株F48E9的F蛋白。 試驗中首先根據(jù)

4、已知的新城疫病毒融合蛋白(FusionproteinF)基因核苷酸序列，設計合成了F基因特異性引物。將F48E9株和LaSota株F基因克隆至桿狀病毒轉移載體pFastBacTMHTa中，分別構建重組質粒pFastBacHT-F48F、pFastBacHT-LaF，然后轉化E.coliDH5α，以LB/AMP±平板篩選陽性重組子并測序。測序正確后轉化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細胞中，經(jīng)慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素三種抗性培養(yǎng)和用I

5、PTG、X-gal進行藍白斑篩選，篩選出白色菌落，經(jīng)PCR鑒定證明獲得陽性穿梭轉座子rBacmid-F(分別命名為rBacmid-F48F和rBacmid-LaF)，提取重組BacmidDNA，在質脂體轉染試劑Cellfectin介導下，轉染Sf9昆蟲細胞。在昆蟲細胞內(nèi)，重組Bacmid經(jīng)復制、表達、裝配、形成重組桿狀病毒，經(jīng)PCR擴增，證明目的基因片段插入到桿狀病毒基因組中，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，證實NDV