4p11-4p14區(qū)域TLRs家族成員基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、1.研究背景與目的 鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)是我國(guó)南方各省及東南亞常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其中廣東省是全世界最高發(fā)的地區(qū)，世界人口標(biāo)化發(fā)病率高達(dá)男30/10萬(wàn)，女13/10萬(wàn)。目前的研究結(jié)果公認(rèn)遺傳因素、環(huán)境因素、EB病毒(Epstein-BarrVirus，EBV)感染及其三者之間的相互作用是鼻咽癌發(fā)生的重要病因?qū)W模型。鼻咽癌具有顯著的地區(qū)差異、家族聚集現(xiàn)象，移民流行病學(xué)研究的證據(jù)和復(fù)合分離

2、分析研究結(jié)果均提示遺傳因素在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。EB病毒感染又是鼻咽癌的重要病因，環(huán)境致癌因素則伴隨著整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程。立足于遺傳—環(huán)境相互作用，鼻咽癌相關(guān)基因的研究涉及到了人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HumanLeukocyteAntigen，HLA)分子、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶M1(GlutathioneS-TransferaseM1，GSTM1)、細(xì)胞色素P4502E1酶(CytochromeP4502E1enzyme，CYP2E1)、多

3、聚免疫球蛋白受體(Polyimmunoglobulinreceptor，PIGR)、T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)、DNA修復(fù)基因等，但始終沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一個(gè)類(lèi)似于乳腺癌易感基因BRCA1的主效基因在鼻咽癌的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。本研究小組對(duì)23個(gè)持粵語(yǔ)方言的鼻咽癌高發(fā)家系進(jìn)行連鎖分析將鼻咽癌的易感基因定位于4p15.1-4q12區(qū)域。進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)高發(fā)家系的單體型分析，將易感區(qū)域縮小至4p11-4p14區(qū)域。核心家系的TDT

4、分析，結(jié)果提示在4號(hào)染色體微衛(wèi)星標(biāo)記D4S350處連鎖不平衡最顯著，此處極可能存在鼻咽癌易感基因。此后本研究小組一直致力于采用候選克隆方法在此區(qū)域內(nèi)篩選鼻咽癌潛在致病基因。 最近我們研究了部分免疫反應(yīng)相關(guān)基因，特別著重于Toll樣受體(Tolllikereceptor，TLR)家族成員。Toll樣受體家族的三個(gè)基因TLR1、TLR6和TLR10恰好位于4p11-4p14區(qū)內(nèi)。Toll首先是在果蠅胚胎時(shí)期背腹極向分化中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵蛋

5、白。后來(lái)發(fā)現(xiàn)它在果蠅抗真菌感染的固有免疫中起到了關(guān)鍵作用。人類(lèi)Toll樣受體家族屬于白介素1受體超家族，與白介素1受體超家族成員胞內(nèi)部分同源。病原分子是它們識(shí)別的內(nèi)外源性配體。TLRs將識(shí)別信號(hào)傳遞到核指導(dǎo)有關(guān)細(xì)胞因子合成，從而有機(jī)連接了固有免疫和適應(yīng)性免疫。有研究表明TLRs家族識(shí)別內(nèi)源性病毒核酸，但TLRs受體與EB病毒感染之間關(guān)系的研究尚無(wú)報(bào)道。 本研究的目的就是基于鼻咽癌易感基因定位的結(jié)果，采用位置候選克隆策略和功能候選

6、策略在4p11-4p14區(qū)域內(nèi)，針對(duì)Toll樣受體家族的三個(gè)基因TLR1、TLR6和TLR10，用PCR—測(cè)序的方法，篩查是否存在與高發(fā)區(qū)鼻咽癌患者相關(guān)聯(lián)的序列變異，為鼻咽癌易感基因功能研究尋找到合適的遺傳學(xué)候選者。希望找到與鼻咽癌相關(guān)聯(lián)的SNP，或SNP單體型。本研究的創(chuàng)新之處在于首次在鼻咽癌患者中檢測(cè)了TLR1、TLR6和TLR10基因序列變異，探討了三個(gè)基因單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌易感性的關(guān)系以及三個(gè)基因單核苷酸多態(tài)性與EB病毒感染

7、的關(guān)聯(lián)性。 2.研究方法 本研究在既往采用24份散發(fā)鼻咽癌樣本篩選到的TLR6-TLR1-TRL10區(qū)域內(nèi)的36個(gè)變異的基礎(chǔ)上，運(yùn)用標(biāo)簽SNP篩選軟件，篩選出13個(gè)代表此區(qū)域內(nèi)95％以上單體型的標(biāo)簽SNP，加上一個(gè)TLR1基因啟動(dòng)子區(qū)的TC插入變異。在480個(gè)持廣州方言的散發(fā)鼻咽癌患者和578個(gè)健康廣府人中，分型確認(rèn)這些位點(diǎn)是否與鼻咽癌發(fā)病有關(guān)。在研究中，PCR擴(kuò)增采用多重PCR和單一PCR相結(jié)合的方法，大大節(jié)約了DNA

8、模板的用量。引物設(shè)計(jì)用在線(xiàn)PRIMER3.0軟件。所有PCR反應(yīng)均在PE9700PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，產(chǎn)物用酶解純化于ABI377測(cè)序儀上測(cè)序，SNP分型采用了直接測(cè)序法。序列讀解采用Phred/Phrap/consed軟件包、DNAStar/Seqman和Chromas軟件。 3.結(jié)果 共篩查了TLR1上5個(gè)變異，TLR6上2個(gè)變異，TLR10上7個(gè)變異，除TLR1上啟動(dòng)子區(qū)一個(gè)雙堿基插入外，其它均為cSNP，其中改變氨

9、基酸的cSNP有9個(gè)。單個(gè)位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析中，在比較TLR1啟動(dòng)子區(qū)TC堿基插入(-5984TCinsertion)純合子(P=0.05，OR=0.452，CI0.204-1.001)、TLR1外顯子上的錯(cuò)義突變Ser44Pro(P=0.048，OR=0.576，CI0.333-0.995)和Asn248Ser(P=0.05，OR=0.589，CI0.346-1.000)在病例組和對(duì)照組中的頻率分布時(shí)，均獲得一個(gè)邊緣性P值。TLR6Val

10、327Met在病例組和對(duì)照組中的分布雖然沒(méi)有顯著差異，在年齡分層分析中發(fā)現(xiàn)這一變異對(duì)于低年齡人群來(lái)說(shuō)可能是一個(gè)危險(xiǎn)因素(P=0.042，OR=1.54，CI1.097-2.163)；性別分層分析發(fā)現(xiàn)，男性中TLR6Ile120Thr(P=0.004，OR=1.725，CI1.185-2.513)和TLR6Val327Met(P=0.012，OR=1.667，CI1.114-2.496)在病例組和對(duì)照組的頻率有顯著差異。在對(duì)照組中分析了T

11、LR變異與EBV感染的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TLR10Gly381Asp的基因型頻率分布在EBV陽(yáng)性組和陰性組有顯著差異(P=0.004，OR=0.564，CI0.348-0.913)，比較TLR10另一同義突變TLR10G1031T的基因型頻率分布在EBV陽(yáng)性組和陰性組的差異，獲得一個(gè)邊緣性P值(P=0.048，OR=1.637，CI1.000-2.681)。 單體型分析發(fā)現(xiàn)這些SNP共構(gòu)成兩個(gè)haplotypeblock，TLR10基因

12、的SNP組成1個(gè)Haplotypeblock，TLR1基因和TLR6基因的SNP組成另一個(gè)Haplotypeblock。經(jīng)Haplo.stats分析，與TLR10最常見(jiàn)的單體型“GAGTGAA”比較，攜帶單體型“GCGTGGC”人群罹患鼻咽癌的危險(xiǎn)性顯著提高(P=0.00462)，經(jīng)過(guò)調(diào)整年齡、性別和VCA-IgA抗體滴度，這種相關(guān)性更加顯著(P=0.00066)。Globalscoretest和Haplo.glm分析均得到與Haplo

13、.stats分析一致的結(jié)果?！癎CGTGGC”在病例組和對(duì)照組中的頻率有顯著性差異(P=0.00242，OR=2.66，CI1.34-3.82)。 與TLR1和TLR6最常見(jiàn)的單體型“GAATGT”比較，攜帶單體型“AAGTGC”人群罹患鼻咽癌的危險(xiǎn)性顯著提高(P=0.017)，經(jīng)過(guò)調(diào)整年齡、性別和VCA-IgA抗體滴度，這種相關(guān)性更加顯著(P=0.00402，OR=4.124，CI1.567-10.858)。 4.討論

14、 本研究采用位置候選克隆策略和功能候選策略，在易感基因候選區(qū)域4p11-4p14對(duì)TLR1、TLR6、TLR1三個(gè)基因進(jìn)行了序列分析，對(duì)13個(gè)標(biāo)簽SNP和1個(gè)啟動(dòng)子區(qū)的雙堿基插入位點(diǎn)進(jìn)行患者和正常人群中的分型。發(fā)現(xiàn)TLR1的3個(gè)位點(diǎn)和TLR6的一個(gè)位點(diǎn)與鼻咽癌發(fā)病存在邊緣關(guān)聯(lián)性。對(duì)這幾個(gè)位點(diǎn)的評(píng)價(jià)需慎重。1)提示這些SNP所在基因可做為鼻咽癌候易感基因或微效基因進(jìn)行下一步研究；2)這些SNP做為遺傳標(biāo)記指示鼻咽癌易感基因在其附近

15、；3)不排除這些SNP與鼻咽癌的假關(guān)聯(lián)，原因可能是抽樣誤差，樣本量太小等等。 在單體型分析中發(fā)現(xiàn)TLR10上一個(gè)人群攜帶率為11.4％的單體型“GCGTGGC”與鼻咽癌發(fā)病相關(guān)(P=0.00462)，這種相關(guān)性在調(diào)整年齡、性別和EBV抗體滴度后更加顯著(P=0.00066)，這一結(jié)果又得到Globalscoretest和Haplo.glm分析的驗(yàn)證。特異性的P值和反復(fù)驗(yàn)證的結(jié)果與TLR10變異與EBV感染關(guān)聯(lián)性的結(jié)果，提示TLR

16、10的這一單體型是一個(gè)鼻咽癌的潛在危險(xiǎn)因素，潛在的遺傳學(xué)改變和EBV感染可能共同作用于鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。 TLR6和TLR1上一個(gè)人群攜帶率為1.9％的單體型“AAGTGC”也與鼻咽癌發(fā)病相關(guān)，經(jīng)過(guò)調(diào)整年齡、性別和VCA-IgA抗體滴度，這種相關(guān)性更加顯著(P=0.00402，OR=4.124，CI1.567-10.858)。由于這一單體型的人群攜帶率相對(duì)較低，這一關(guān)聯(lián)性還有待于在將來(lái)的工作中進(jìn)一步驗(yàn)證。 5.結(jié)論