負性協(xié)同刺激分子B7-H1在人結(jié)直腸癌表達的調(diào)控機制.pdf

1、機體在抗腫瘤、抗感染和自身免疫疾病時，主要通過活化的T淋巴細胞發(fā)揮作用。T細胞的活化不僅需要TCR與抗原肽-MHC復(fù)合物作用產(chǎn)生的第一信號，還需要抗原提呈細胞(APC)表面B7家族協(xié)同刺激分子與T細胞上的相應(yīng)配體結(jié)合產(chǎn)生的第二信號。協(xié)同刺激分子與配體結(jié)合產(chǎn)生正性或負性信號，調(diào)節(jié)T細胞活性，進而調(diào)控機體的免疫反應(yīng)。負性協(xié)同刺激分子B7-H1在多種腫瘤中表達上調(diào)，通過介導(dǎo)腫瘤細胞免疫逃逸而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因PTEN通過

2、負性調(diào)控PI3K/Akt通路，在調(diào)節(jié)細胞生長、增值過程中發(fā)揮了重要作用。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，PTEN分子表達缺失使得PI3K/Akt通路被激活，從而通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制上調(diào)B7-H1的表達。microRNA（miRNA）是一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的3'-UTR互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因翻譯，在基因表達中發(fā)揮著重要的作用。有些異常表達的miRNA參與了腫瘤的發(fā)生與進展。
　　 本課題主要研究人

3、結(jié)直腸癌中異常表達的miRNA通過調(diào)控PTEN途徑對B7-H1分子表達的間接調(diào)控作用。
　　 第一部分人結(jié)直腸癌中miR-20b和miR-130b通過抑制PTEN途徑介導(dǎo)B7-H1分子上調(diào)表達的機制。
　　 [目的]探討miRNA通過調(diào)控PTEN途徑對B7-H1在結(jié)直腸癌表達的作用。
　　 [方法]首先采用免疫組化法測定101例結(jié)直腸癌中B7-H1和PTEN的表達，并對其進行相關(guān)分析。然后，采用miRNA芯片技術(shù)

4、測定6例結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中miRNA的表達量，統(tǒng)計分析癌組織中異常表達的miRNA。在這些miRNA中，使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測可能與PTEN基因3’-UTR作用的miRNA。最后，采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析這些miRNA對PTEN基因表達的調(diào)控作用。
　　 [結(jié)果](1) B7-H1在44.6％的結(jié)直腸癌組織中表達，并且與PTEN的表達水平顯著相關(guān)（P=0.002）;(2)結(jié)直腸癌組織中有30條miRNA表達明顯高于癌

5、旁組織，其中miR-20b、miR-130b、miR-18a和miR-181b可能與PTEN基因3’-UTR結(jié)合;(3)構(gòu)建了含PTEN基因3’-UTR的熒光素酶重組載體，通過酶切和基因測序的方法鑒定正確，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-20b和miR-130b可以通過與含PTEN基因3’-UTR的熒光素酶重組載體結(jié)合而抑制其活性。
　　 [結(jié)論]結(jié)直腸癌組織中，B7-H1表達升高，并與PTEN表達顯著相關(guān)。體外實驗證實miR-20b

6、和miR-130b與PTEN基因的3’-UTR結(jié)合后抑制其分子表達。提示這兩個miRNA通過抑制PTEN表達導(dǎo)致B7-H1分子在腫瘤組織中異常表達。
　　 第二部分人結(jié)直腸癌中B7-H1基因突變影響miR-570結(jié)合導(dǎo)致B7-H1分子的表達。
　　 [目的]研究人結(jié)直腸癌中B7-H1基因突變影響miRNA結(jié)合導(dǎo)致B7-H1分子異常表達的作用。
　　 [方法]采用DNA測序法測定結(jié)直腸癌組織中B7-H1基因3’-U

7、TR的變異;然后采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測可能與堿基變異位點結(jié)合的miRNA;最后，采用體外功能實驗研究miRNA對B7-H1基因表達的抑制作用，以及基因突變對miRNA調(diào)控作用的影響。
　　 [結(jié)果](1) B7-H1基因3’-UTR在37.5％(6/16)的結(jié)直腸癌組織中存在一個G＞C點突變，該突變位于miR-570的結(jié)合靶點內(nèi);(2) miR-570能顯著抑制B7-H1+/SGC-7901人胃癌細胞和B7-H1+/CHO細胞膜

8、上B7-H1蛋白的表達，并能顯著抑制B7-H1/3'-UTR/pGL-3載體和含miR-570作用靶點序列的pGL-3載體表達的熒光素酶蛋白，同時anti-miR-570能明顯上調(diào)B7-H1+/SGC-7901細胞和B7-H1-/MDA-MB-435人乳腺癌細胞上B7-H1表達;(3) miR-570對含C等位基因型B7-H1/3'-UTR/pGL-3載體表達的抑制作用明顯低于G等位基因型。
　　 [結(jié)論]B7-H1基因3’-U