絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙大鼠動物模型建立及通絡(luò)藥物干預作用研究.pdf

1、目的：以絡(luò)病理論為指導，依據(jù)臨床流行病學調(diào)查建立的“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”辨證診斷標準，應用慢性束縛法復合高蛋氨酸飲食建立絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復合動物模型，從大鼠一般狀況、生物學表征評分、行為學及血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能等方面對模型進行綜合評價，并觀察神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NEI)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子的改變，應剛通絡(luò)復方-組分配伍-單味藥物對動物模型進行不同層次的干預。闡明絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙的生物學基礎(chǔ)，探討中醫(yī)證候因素在血管內(nèi)皮功能障礙

2、發(fā)病中的作用，并對通絡(luò)藥物干預作用做出綜合評價。 方法： 1. 絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙動物模型建立與評價 采用慢性束縛法建立絡(luò)氣郁滯大鼠證候模型，以高蛋氨酸飲食建立內(nèi)皮功能障礙大鼠病理模型，基于束縛應激即刻引起血清同型半胱氨酸(HCY)增高、一氧化氮(NO)明顯下降，將慢性束縛法與高蛋氨酸飲食復合建立絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復合動物模型。將清潔級健康雄性Wistar大鼠40只按體重隨機分為4組：①正常對

3、照組：正常飲食；②絡(luò)氣郁滯證候模型組(絡(luò)氣郁滯組)：正常飲食，束縛6小時/日；③血管內(nèi)皮功能障礙病理模型組(病理模型組)：3％蛋氨酸飲食；④絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復合模型組(復合模型組)：3％蛋氨酸飲食+束縛6小時/日。造模時間為6周。記錄大鼠的一般狀況(精神、皮毛、攝食量、體重)：實驗前后行1％蔗糖水攝取量試驗，實驗末進行生物學表征評分、曠場試驗、尾懸掛試驗。放免法檢測血漿內(nèi)皮素(ET)，硝酸還原酶法檢測血清NO；光鏡觀察胸主

4、動脈形態(tài)學變化，透射電鏡觀察主動脈組織內(nèi)皮細胞(EC)超微結(jié)構(gòu)變化；免疫組化法檢測主動脈組織中內(nèi)皮素-1(ET-1)的表達；循環(huán)酶法測定血清HCY水平。 2. 絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子變化 實驗動物、分組、造模方法同上，實驗末檢測NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子：放免法檢測血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、糖皮質(zhì)激素(CORT)、腎素(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固

5、酮(ALD)及血清中白介素1β(IL-1β)、白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)：ELISA法檢測去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、γ，干擾素(γ-INF)、5羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)；計算胸腺和脾臟指數(shù)。 3. 通絡(luò)藥物對復合模型干預作用研究 將清潔級健康雄性Wistar大鼠50只按體重隨機分為復合模型組、復方通絡(luò)(通心絡(luò))、組分配伍(薤白四味)、單味藥物(薤白有效部位

6、)、貝那普利組共5組，造模方法及造模時間同上，通心絡(luò)組為1.2g生藥/Kg/d，薤白四味組為3.47g生藥/Kg/d，薤白組為1.2g生藥/Kg/d，貝那普利組為10mg/Kg/d，連續(xù)灌胃給藥6周；復合模型組按體重灌服0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液。觀察大鼠的生物學表征、血管內(nèi)皮功能、主動脈組織形態(tài)學及內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)、NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子變化，檢測方法同上。 4. 絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙大鼠主動脈組織葡萄糖調(diào)節(jié)

7、蛋白78(GRP78)表達及通絡(luò)藥物干預作用 將清潔級健康雄性Wistar大鼠80只按體重隨機分為正常對照組、絡(luò)氣郁滯組、病理模型組、復合模型組、通心絡(luò)組、薤白四味組、薤白單味組、貝那普利組共8組，造模方法、造模時間及藥物干預同上，實驗末無菌取主動脈組織，利用RT-PCR和Western blot方法檢測各組大鼠主動脈組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的基因和蛋白表達。 結(jié)論： 1. 絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙動物模型建立及

8、評價 依據(jù)通過臨床流行病學調(diào)查建立的絡(luò)氣郁滯型內(nèi)皮功能障礙臨床辨證診斷標準，采用慢性束縛法建立絡(luò)氣郁滯大鼠證候模型，以高蛋氨酸飲食建立內(nèi)皮功能障礙大鼠病理模型，基于束縛應激即刻引起血清HCY增高，NO明顯下降，以“束縛+蛋氨酸飲食”首次建立絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復合大鼠模型。采用一般狀況觀察、生物學表征評分、行為學指標和血管內(nèi)皮形態(tài)和功能檢測等半定量和定量檢測方法對上述模型進行綜合評價。研究表明，絡(luò)氣郁滯證候模型既表現(xiàn)出

9、明顯的精神萎靡，反應遲鈍，攝食量減少、體重增長緩慢等證候表現(xiàn)，又表現(xiàn)出明顯的內(nèi)皮形態(tài)和功能的改變，顯示出絡(luò)氣郁滯證候因素在血管內(nèi)皮功能障礙發(fā)病中發(fā)揮重要作用。病理模型僅有內(nèi)皮形態(tài)和功能改變而無明顯的精神萎靡等癥狀。復合模型大鼠表現(xiàn)出絡(luò)氣郁滯證候特征性的同時出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙，更充分地體現(xiàn)出臨床疾病特點和證候特征信息。 2. 絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙大鼠NEI網(wǎng)絡(luò)的變化特征 通過對正常對照組、絡(luò)氣郁滯組、病理模型組、復合模

10、型組大鼠NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子檢測探討其變化特征，對比分析絡(luò)氣郁滯證候因素在血管病變中的重要作用。結(jié)果表明與正常對照組比較，絡(luò)氣郁滯組、病理模型組、復合模型組均不同程度存在下丘腦-垂體-腎上腺軸、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、單胺類遞質(zhì)下降，免疫系統(tǒng)能力下降；絡(luò)氣郁滯組與復合模型組交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)激活，而病理模型組此系統(tǒng)變化不明顯。與絡(luò)氣郁滯組和病理模型組比較，復合模型顯示出絡(luò)氣郁滯證和病理模型的非線性疊加效應。揭示既往未被重視

11、的證候因素是血管病變發(fā)生的重要影響因素。NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子的紊亂可能是絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙的生物學基礎(chǔ)之一。 3. 通絡(luò)藥物對絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙火鼠的干預作用 以通絡(luò)復方(通心絡(luò))、通絡(luò)藥物組分配伍(薤白四味)、單味通絡(luò)藥物(薤白)分別干預絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型，三個層次通絡(luò)藥物均可以改善大鼠的一般狀況及生物學評分，提高蔗糖水攝取量，改善大鼠的情志抑郁癥狀，改善內(nèi)皮功能，不同程度抑制下丘腦-垂體-腎

12、上腺皮質(zhì)軸、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的激活，升高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，增強免疫功能，調(diào)節(jié)NEI網(wǎng)絡(luò)。各通絡(luò)藥物組改善行為學、內(nèi)皮功能、NEI網(wǎng)絡(luò)指標優(yōu)于對照藥貝那普利，尤其在改善一般狀況和行為學方面，三個層次類通絡(luò)藥物作用明顯優(yōu)于貝那普利，其中通心絡(luò)作用更為明顯，可能與復方通絡(luò)藥物針對血管病變共性病理環(huán)節(jié)配伍有關(guān)，在動物模型實驗層面佐證了辨證論治及病、證、法、藥的關(guān)聯(lián)性與科學性。通絡(luò)干預絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙

13、模型呈現(xiàn)出通過調(diào)節(jié)疾病狀態(tài)下NEI網(wǎng)絡(luò)多個系統(tǒng)的紊亂狀態(tài)，重建機體內(nèi)多個系統(tǒng)之間的自穩(wěn)調(diào)控機制，以達到動態(tài)平衡的效應目標，為揭示通絡(luò)復方的效應規(guī)律提供思路。 4. 絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙大鼠主動脈組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達的變化 近來的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，是線粒體應激、核應激的共同通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應是細胞本身的一種自我保護性機制，但是反應功能障礙或者過強的和長時間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激都可以引起細胞功能失調(diào)，甚至細胞死亡等病