絡(luò)氣虛滯(過逸傷氣)型血管內(nèi)皮功能障礙病生理學(xué)機(jī)制及通絡(luò)方藥的干預(yù)研究.pdf

1、目的：本研究在絡(luò)病理論指導(dǎo)下，依據(jù)中醫(yī)“久臥傷氣”之說，建立絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合模型，探討“絡(luò)氣虛滯”狀態(tài)下血管內(nèi)皮功能改變、全身性NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控變化規(guī)律及二者的內(nèi)在聯(lián)系；初步闡明模型大鼠內(nèi)皮功能障礙發(fā)生的局部免疫損傷機(jī)制；利用體外細(xì)胞培養(yǎng)從基因與蛋白水平揭示NEI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵化學(xué)信號分子異常改變與血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)的分子機(jī)制，從而闡明過逸所致絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病生理學(xué)機(jī)制，并探索不同類別通絡(luò)藥物的作用機(jī)制，為絡(luò)

2、病理論指導(dǎo)血管病變防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.絡(luò)氣虛滯（過逸傷氣）型血管內(nèi)皮功能障礙大鼠模型的建立及通絡(luò)方藥的干預(yù)作用
　　 本研究在HHcy致血管內(nèi)皮功能障礙這一病理模型的基礎(chǔ)上，依據(jù)“久臥傷氣”中醫(yī)理論，施加“高營養(yǎng)飲食+限制活動”因素建立絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合大鼠模型。120只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為以下8組：（1）正常對照組；（2）血管內(nèi)皮功能障礙模型組（HCY組）；（3）

3、絡(luò)氣虛滯證候模型組（證候模型組）；（4）絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型組（復(fù)合模型組）；（5）復(fù)合模型+人參組（人參組）；（6）復(fù)合模型+四昧通絡(luò)組（四味通絡(luò)組）；（7）復(fù)合模型+通心絡(luò)組（通心絡(luò)組）；（8）復(fù)合模型+辛伐他汀組（辛伐他汀組）。每組15只。正常對照組與HCY組大鼠置于代謝籠中（單籠），前者飼以普通飼料，后者喂飼含3％高蛋氨酸飼料，自由飲水；證候模型組、復(fù)合模型組與用藥組大鼠分別置于經(jīng)改造過的代謝籠中（單籠），籠內(nèi)空間以其

4、保持基本安靜且能夠轉(zhuǎn)身移動為標(biāo)準(zhǔn)，均飼以高營養(yǎng)飼料，其中證候模型組大鼠飼料中不含3％高蛋氨酸，其他各組均含，所有大鼠均自由飲水。實(shí)驗(yàn)開始按1ml/100g體重給予各用藥組動物相應(yīng)藥物口服灌胃，正常對照組與各模型組大鼠給予等量的0.5％ CMC-Na灌胃。共計10周。參照已建立的絡(luò)氣虛滯辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過對大鼠生物學(xué)表征半定量評分、力竭游泳時間、呼吸與心率、主動脈內(nèi)膜（內(nèi)皮細(xì)胞）病理組織形態(tài)學(xué)光鏡、電鏡觀察及反映血管內(nèi)皮功能相關(guān)生化指標(biāo)的

5、檢測，對模型做出綜合客觀評價，并觀察三種不同類型通絡(luò)方藥的干預(yù)作用。
　　 2.絡(luò)氣虛滯（過逸傷氣）型血管內(nèi)皮功能障礙模型大鼠NEI網(wǎng)絡(luò)變化及通絡(luò)方藥干預(yù)作用
　　 研究應(yīng)用絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合大鼠模型，以NEI網(wǎng)絡(luò)中共同化學(xué)信號分子為切入點(diǎn)，通過檢測大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸：下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（ELISA法）、血漿促腎上腺皮質(zhì)激素（放免法）、血清皮質(zhì)酮（放免法）；下丘腦-垂體-甲狀腺軸：下丘

6、腦促甲狀腺素釋放激素（ELISA法）、血清促甲狀腺激素（放免法）、三碘甲狀腺原氨酸及甲狀腺素（放免法）；外周血免疫細(xì)胞因子：白細(xì)胞介素-1β、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α（放免法）等指標(biāo)，觀察“絡(luò)氣虛滯”證候狀態(tài)下“氣絡(luò)——NEI網(wǎng)絡(luò)”調(diào)控變化規(guī)律及通絡(luò)方藥的干預(yù)作用、運(yùn)用典型相關(guān)分析方法揭示NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡與血管內(nèi)皮功能障礙之間的內(nèi)在聯(lián)系。
　　 3.絡(luò)氣虛滯（過逸傷氣）病證復(fù)合模型大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷免疫學(xué)機(jī)制及通絡(luò)方藥的

7、干預(yù)作用
　　 研究通過對模型大鼠外周血抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體（ELISA法）、主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-Ⅱ類分子以及細(xì)胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法及半定量分析）的檢測，對局部血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫損傷機(jī)制進(jìn)行深入研究，從另一角度闡明模型大鼠的病生理學(xué)機(jī)制并觀察通絡(luò)方藥的干預(yù)作用。
　　 4.p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在TNF-α誘導(dǎo)HUVEC分泌ET-1與eNOS中的作用及通絡(luò)方藥的影響<

8、br>　　 本研究在離體條件下觀察TNF-α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞表達(dá)ET-1與eNOS以及p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中的作用，通過檢測不同濃度TNF-α（0、2.5、5、10、15、20ng/ml）在不同時間（0、1、2、4、8、12、24h）干預(yù)后HUVEC培養(yǎng)上清液中ET-1、eNOS含量；Western blot與Real timeRT-PCR檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1、eNOS蛋白及mRNA表達(dá)：（1）正常對照組；（2） T

9、NF-α組：細(xì)胞中加入終濃度為10ng/ml的TNF-α；（3）SB203580組：SB203580（終濃度為25μmol/L）預(yù)孵育細(xì)胞1h，然后加入終濃度為10ng/ml的TNF-α；（4）-（6）通心絡(luò)干預(yù)組：通心絡(luò)超微粉（終濃度依次為100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml）預(yù)孵育細(xì)胞1h，然后加入終濃度為10ng/ml的TNF-α；（7）-（9）辛伐他汀干預(yù)組：辛伐他汀（終濃度依次為0.1μmol/L、1μmol

10、/L、10μmol/L）預(yù)孵育細(xì)胞1h，然后加入終濃度為10ng/ml的TNF-α，每組3個復(fù)孔。
　　 結(jié)論：
　　 1.首次建立過逸絡(luò)氣虛滯動物模型
　　 《素問·宣明五氣篇》云：“久臥傷氣”；張介賓亦云：“久臥則陽氣不伸，故傷氣；久坐則血脈滯于四體，故傷肉”，人體需要適當(dāng)?shù)幕顒樱瑲庋拍芰鲿?，陽氣才能得以振奮。本研究區(qū)別于既往采用疲勞法建立氣虛證動物模型的思路，依據(jù)中醫(yī)“久臥傷氣”病機(jī)理論，同時緊密結(jié)合臨床

11、部分人群生活習(xí)慣過于安逸，易多發(fā)心腦血管疾病的現(xiàn)狀，首次構(gòu)建過逸絡(luò)氣虛滯動物模型，對于深入探討上述人群血管病變發(fā)生發(fā)展的病生理學(xué)機(jī)制和臨床治療具有現(xiàn)實(shí)意義與借鑒價值。
　　 2.絡(luò)氣虛滯（過逸傷氣）型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合模型的建立為深入研究其病生理機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)平臺
　　 本研究以HHcy致血管內(nèi)皮功能障礙為基礎(chǔ)病理模型，施加“高營養(yǎng)飲食+限制活動”證候因素制備絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合模型，結(jié)果顯示模型大鼠

12、生物學(xué)表征顯著改變，力竭游泳時間明顯縮短，心率及呼吸頻率增高，其表現(xiàn)基本體現(xiàn)“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)中絡(luò)氣虛滯證候特征；主動脈內(nèi)膜（內(nèi)皮細(xì)胞）形態(tài)病理學(xué)觀察及血液生化指標(biāo)檢測證實(shí)模型大鼠出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能障礙，綜合分析表明模型建立成功，為深入研究其病生理機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)平臺。
　　 3.絡(luò)氣虛滯證候狀態(tài)下全身性NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡與局部血管內(nèi)皮免疫損傷共同成為內(nèi)皮功能障礙發(fā)生發(fā)展的重要病生理機(jī)制
　　 本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合

13、模型大鼠體內(nèi)與NEI網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)的關(guān)鍵化學(xué)信號分子存在異常改變，具體表現(xiàn)在下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進(jìn)、下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能抑制、IL-1β、TNF-α和IFN-γ等免疫細(xì)胞因子異常增高。典型相關(guān)分析證實(shí)其與血管內(nèi)皮功能障礙之間密切相關(guān)，主要體現(xiàn)在NO、ET和TNF-α、IL-1β、HPAA之間相互影響，提示全身性NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡可能是絡(luò)氣虛滯（過逸傷氣）證候狀態(tài)下血管內(nèi)皮功能障礙發(fā)生發(fā)展的重要病生理學(xué)機(jī)制之一。同時，模型大鼠

14、血清AECA含量顯著升高、主動脈內(nèi)皮細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子以及ICAM-1、VCAM-1等粘附分子表達(dá)明顯增強(qiáng)，這不僅是血管內(nèi)皮損傷的免疫學(xué)基礎(chǔ)，也是絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙發(fā)生的局部病生理學(xué)機(jī)制之一。證候因素在上述機(jī)制的產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且與病理因素HHcy存在非線性疊加效應(yīng)。
　　 4.血管內(nèi)皮功能障礙是絡(luò)氣虛滯證候狀態(tài)下的局部病理損傷
　　 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，任何一種疾病都是整體機(jī)能失調(diào)下的局部病理表現(xiàn)。本研究中單純證

15、候因素即可誘發(fā)大鼠全身性NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡，同時表現(xiàn)出局部血管內(nèi)皮受損與功能障礙，復(fù)合模型典型相關(guān)分析顯示二者存在顯著相關(guān)性，充分表明后者是絡(luò)氣虛滯證候狀態(tài)下的局部病理損傷。絡(luò)氣虛滯證候可通過全身NEI網(wǎng)絡(luò)紊亂加重血管損傷。此外，這一結(jié)果也提示改正不良生活習(xí)慣和方式，調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)及適當(dāng)加強(qiáng)體育鍛煉對于血管病變的防治具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
　　 5.通絡(luò)藥物充分體現(xiàn)出對血管內(nèi)皮功能障礙的整合調(diào)節(jié)優(yōu)勢
　　 三種不同類別通絡(luò)方藥

16、均可明顯改善復(fù)合模型大鼠絡(luò)氣虛滯證候，減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度，有效保護(hù)血管內(nèi)皮功能；同時，通絡(luò)方藥可不同程度地抑制復(fù)合模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進(jìn)、增強(qiáng)下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能、降低異常增高的免疫細(xì)胞因子，從而改善NEI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的失衡狀態(tài)，可顯著降低模型大鼠血清AECA含量、抑制主動脈內(nèi)皮細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子以及ICAM-1、VCAM-1等粘附分子表達(dá)。上述對全身性NEI網(wǎng)絡(luò)平衡以及局部內(nèi)皮免疫損傷機(jī)制的調(diào)節(jié)可能是其改善絡(luò)氣虛

17、滯型血管內(nèi)皮功能障礙的關(guān)鍵作用機(jī)制。通絡(luò)復(fù)方中藥對機(jī)體多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)良性整合調(diào)節(jié)的系統(tǒng)效應(yīng)，凸顯中藥既可有效改善“局部/血管內(nèi)皮功能障礙”又能著眼“整體/氣絡(luò)-NEI網(wǎng)絡(luò)”，較之陽性藥單純改變局部病理損傷更加具有治療優(yōu)勢。
　　 6.細(xì)胞水平研究為深入闡明NEI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵化學(xué)信號分子異常改變與血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)
　　 本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過p38 MAPK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)HUVE