吉蘭-巴雷綜合征相關(guān)空腸彎曲菌cstⅡ基因序列對比研究.pdf

1、目的:空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)是一種微需氧的革蘭氏陰性彎曲短桿菌,是世界范圍內(nèi)感染性腹瀉常見的病原菌。急性、自限性腸炎是Cdejuni感染后的典型表現(xiàn),某些類型C.jejtmi菌株感染后還可引起自身免疫性疾病——吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome,GBS)。C.jejuni被認(rèn)為是GBS最重要的前驅(qū)感染病原。C.jejuni菌體表面的脂寡糖(lipooligo

2、saccharide,LOS)結(jié)構(gòu)與周圍神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)苷脂之間由于形態(tài)相似可發(fā)生分子模擬導(dǎo)致交叉免疫損傷是C.jejuni感染后發(fā)生GBS的主要機(jī)制。cstⅡ基因編碼alpha2,3/8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶,將唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)至LOS末端糖鏈從而產(chǎn)生唾液酸化的LOS,對產(chǎn)生多種形態(tài)的LOS至關(guān)重要。
　　 本研究通過序列比對獲得3株GBS相關(guān)C.jejuni的cstⅡ基因序列,并與GeneBank中GBS無關(guān)C.jejuni相應(yīng)基因序列進(jìn)行配

3、對對比,尋找可能與GBS致病性相關(guān)的基因突變和蛋白高級結(jié)構(gòu)變化,并觀察這種變化是否在其他GBS相關(guān)菌株中同樣存在,了解GBS相關(guān)C.jejuni的cstⅡ序列特征,并分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。
　　 方法:選取分離自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科GBS患者糞便并經(jīng)動物模型證實為致GBS的3株C.jejuni菌株:lulei株,qiaoyuntao株,zhanxing株進(jìn)行培養(yǎng),其血清型分別為penner O:19型,penner O:2

4、型,penner O:5型。應(yīng)用Wizard基因提取試劑盒提取C.jejuni基因組DNA。將菌株基因組DNA送至Analytical Genetics Technology Centre,UniversityHealth Network,Toronto Princess Margaret Hospital進(jìn)行測序。從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得3株GBS無關(guān)的C.jejuni的cst-Ⅱ基因序列及5株GBS相關(guān)的C.jejuni的cst-Ⅱ基因

5、序列,用DNASTAR-MegAlign軟件,以ClustalW命令對所得的C.jejuni株的cstⅡ基因片段做核酸,氨基酸及氨基酸二級結(jié)構(gòu)的多序列比對,尋找兩種菌株間可能導(dǎo)致C.jejuni致病能力差異的堿基突變及其高級結(jié)構(gòu)改變,分析其致GBS的可能機(jī)制,并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。
　　 結(jié)果:3株致GBS的Cjejuni菌株cst基因均由876個堿基構(gòu)成。與GBS無關(guān)的cstⅡ基因序列相比,qiaoyuntao株,lulei株,和

6、zhanxing株分別有9,19和3個堿基突變,依次導(dǎo)致3,7,1個氨基酸突變。其中,lulei株與qiaoyuntao株共有9個相同的堿基突變:342位堿基A→T,544-546位堿基CCC→AAT,805位堿基G→A。導(dǎo)致了3個相同的氨基酸突變:114位氨基酸E→D,182位氨基酸R→N,269位氨基酸V→I。在這三個相同的氨基酸突變中,114位和182位氨基酸突變在其他GBS相關(guān)菌株中同樣存在。Zhanxing株cstⅡ的氨基酸突

7、變:169位氨基酸E→G位于182位氨基酸附近。三株本地菌株cstⅡ基因的氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)的第七個α螺旋長度均短于GBS無關(guān)菌株在該位置(165～180區(qū)段)的α螺旋,而其被打開的α螺旋均形成了折疊或轉(zhuǎn)角,體現(xiàn)了共同的變化趨勢.,而該變化在其他GBS相關(guān)菌株的二級結(jié)構(gòu)變化中同樣得到體現(xiàn)。
　　 75％的GBS相關(guān)菌株cstⅡ基因51位氨基酸為天冬酰胺(Asn,N),表達(dá)雙功能唾液酸轉(zhuǎn)移酶。25％GBS相關(guān)菌株及所有GBS無關(guān)菌

8、株cstⅡ基因51位氨基酸為蘇氨酸(Thr,T),表達(dá)單功能唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
　　 遺傳距離計算,lulei株與qiaoyuntao株相似度98.4％,遺傳距離1.6％,與其他菌株遺傳距離0％～2.8％;zhanxing株與lulei株相似度97％,遺傳距離3.0％,與其他菌株遺傳距離0.3％～3.O％,qiaoyuntao株與zhanxing株相似度98.6％,遺傳距離1.4％,與其他菌株遺傳距離1.0％～1.6％。
　　

9、 結(jié)論:三株本地菌株cstⅡ基因的氨基酸二級結(jié)構(gòu)的165～180區(qū)段體現(xiàn)了共同的變化趨勢.,而該變化在其他GBS相關(guān)菌株的二級結(jié)構(gòu)變化中同樣存在。這種GBS相關(guān)菌株在氨基酸二級結(jié)構(gòu)上的共同變化趨勢提示該區(qū)段可能為使菌株具有致GBS能力的責(zé)任區(qū)段。該區(qū)段高級結(jié)構(gòu)的改變很可能影響了唾液酸轉(zhuǎn)移酶的功能活性從而改變神經(jīng)節(jié)苷脂表位的形態(tài),使得C.jejuni菌株獲得GBS致病性。本研究中涉及的大部分GBS相關(guān)菌株的cstⅡ基因均表達(dá)雙功能唾液酸