古蘭-巴雷綜合征源空腸彎曲菌致周圍神經(jīng)病Hartley豚鼠模型建立.pdf

1、目的:建立吉蘭-巴雷綜合征源空腸彎曲菌感染致周圍神經(jīng)病Hartley豚鼠模型，為進(jìn)一步探討以空腸彎曲菌為感染源，經(jīng)胃腸道自然感染，引起繼發(fā)性免疫相關(guān)性疾病的發(fā)病模式，為研究吉蘭-巴雷綜合征的感染途徑，發(fā)病機(jī)制及其神經(jīng)病理奠定研究模型基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)空腸彎曲菌:選取河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱保存的吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）患者分離培養(yǎng)出

2、的空腸彎曲菌菌株lulei株，室溫溶化后取100ul菌液加入到含5ml布氏肉湯培養(yǎng)基的無菌西林瓶?jī)?nèi)，置于三氣培養(yǎng)箱，42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)培養(yǎng)24小時(shí)。傳代至含7％無菌脫纖維羊血的哥倫比亞血平板培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)24小時(shí)，純化后制備菌懸液。
　　 2.鑒定空腸彎曲菌:革蘭染色、過氧化物試驗(yàn)、馬尿酸水解試驗(yàn)。
　　 3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:采用4-6周齡，體重為250-300g，雌雄各半的SPF級(jí)健

3、康Hartley豚鼠48只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組36只和對(duì)照組(D組)12只，實(shí)驗(yàn)組分為活菌灌喂組（A組）、死菌灌喂組（B組）、免疫灌喂組（C組），每組各12只。
　　 4.給菌途徑及濃度:實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均經(jīng)口服灌喂3×108cfu/ml菌懸液2ml;對(duì)照組動(dòng)物口服灌喂生理鹽水2ml，灌喂前均禁食12小時(shí)不禁水，灌胃后即給食水。
　　 5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察:自灌喂當(dāng)日起每日觀察Hartley豚鼠的臨床癥狀:飲食、大便，體重及肢體活動(dòng)等

4、情況。
　　 6.糞便培養(yǎng):各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于灌喂前，灌喂24小時(shí)后連續(xù)糞便培養(yǎng)、分離空腸彎曲菌。
　　 7.解剖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:稱重后用4％水合氯醛(10ul/g)腹腔注射麻醉動(dòng)物，常規(guī)皮膚消毒后打開胸腔，暴露心臟后以4％多聚甲醛灌注泵灌注，灌注后取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，臂叢神經(jīng)，腦，脊髓組織，所有組織均用4％多聚甲醛固定24小時(shí)后二次取材進(jìn)行神經(jīng)病理檢查，實(shí)驗(yàn)結(jié)束交予河北神經(jīng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　　 8.神經(jīng)病理檢

5、查:采用HE染色，免疫組化，鋨酸染色觀察神經(jīng)病變。
　　 結(jié)果:
　　 1.臨床觀察:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物A3組（連續(xù)攻毒4周），A4組（連續(xù)攻毒5周）各有一只出現(xiàn)活動(dòng)減少，食欲減退，體重減輕癥狀，占總數(shù)的5.6％(2/36);余實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物未出現(xiàn)明顯臨床癥狀。
　　 2.周圍神經(jīng)病變:
　　 活菌灌喂組（A組）:顯示連續(xù)灌喂2周，3周，4周各分組中3只豚鼠周圍神經(jīng)均出現(xiàn)病理改變，表現(xiàn)為HE染色可見神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)

6、多樣，軸索腫脹。免疫組織化學(xué)染色:鼠抗人神經(jīng)細(xì)絲蛋白單克隆抗體示:神經(jīng)絲粗細(xì)不等，節(jié)段性萎縮;兔抗人髓磷脂堿性蛋白:髓鞘厚度均一，未見脫髓鞘樣改變。鋨酸染色:可見神經(jīng)皺縮、髓鞘塌陷。連續(xù)灌喂5次分組中有一只出現(xiàn)上述病理改變，余兩只HE染色示正常神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)，未見明顯病理改變。
　　 死菌灌喂組（B組）:各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)病理染色未見明顯改變。
　　 免疫灌喂組（C組）:再次免疫2周，3周實(shí)驗(yàn)組中各有一只出現(xiàn)上述病理改變，再

7、免4周組中3只全部出現(xiàn)病理改變，余未出明顯病理改變。
　　 空白對(duì)照組（D組）:各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)病理染色未見明顯改變。
　　 3.糞便培養(yǎng):各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前糞便培養(yǎng)空腸彎曲菌均為陰性;A組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于灌喂后24小時(shí)連續(xù)每天糞便培養(yǎng)可見空腸彎曲菌，余各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌喂后24小時(shí)培養(yǎng)空腸彎曲菌為陰性。
　　 結(jié)論:
　　 1.SPF級(jí)健康Hartley豚鼠胃腸道內(nèi)無空腸彎曲菌。
　　 2.吉蘭-巴雷綜