空腸彎曲菌致豚鼠不同時間段周圍神經(jīng)病理損傷的研究.pdf

1、目的：
　　1、通過經(jīng)消化道感染空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni），構(gòu)建豚鼠周圍神經(jīng)損傷模型。
　　2、觀察豚鼠經(jīng)消化道感染空腸彎曲菌后，不同時間段內(nèi)周圍神經(jīng)的病理損傷有何差異，從而為建立空腸彎曲菌相關(guān)的周圍神經(jīng)病的動物模型提供參考依據(jù)。
　　方法：
　　1、制備空腸彎曲菌菌懸液
　　選取自AMAM型GBS患者糞便中分離、培養(yǎng)的空腸彎曲菌lulei株，經(jīng)中國和美國疾病預(yù)

2、防控制中心鑒定為空腸彎曲菌。將該菌在42℃微需氧條件下(10％CO2、5％O2、85％N2)培養(yǎng)24小時后傳代至哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24小時，并連續(xù)傳至第3代純化菌株。并經(jīng)革蘭氏染色、馬尿酸水解實驗以及分子生物學(xué)進行細菌鑒定后，收取菌株制備成濃度為3×109CFU/ml的菌懸液。
　　2、實驗動物分組
　　購買SPF級4周齡Hartley豚鼠55只，飼養(yǎng)一周。按照體重、體重增長速度及毛色等條件篩選出50只健康豚鼠。將

3、篩選出的50只健康豚鼠，隨機分為布氏肉湯組A（10只）、空白對照組B（10只）、實驗組E(30只)。
　　根據(jù)不同的解剖時間（末次灌喂后第1、2、3、4、5周）將布氏肉湯組和對照組再次隨機分成5個亞組（各2只），布氏肉湯組A分別標(biāo)記為A1、A2、A3、A4、A5;空白對照組B分別標(biāo)記為B1、B2、B3、B4、B5;
　　根據(jù)不同的解剖時間（末次灌喂后第1、2、3、4、5周）將實驗組30只豚鼠再次隨機分為5個亞組（各6只），分

4、別標(biāo)記為E1、E2、E3、E4、E5組。
　　若豚鼠出現(xiàn)癱瘓等明顯的臨床癥狀，因?qū)嶒灲M的干預(yù)處理是統(tǒng)一的，可以將發(fā)生癱瘓的豚鼠合并為一組，標(biāo)記為實驗組T。篩選后余下的5只豚鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，設(shè)為備用對照組，其中3只處理同布氏肉湯組，2只同空白對照組。
　　3、造模方案
　　實驗組（E組）豚鼠給予灌喂活菌菌懸液，每只豚鼠在每次灌喂前禁食15小時、禁水4小時。每周中連續(xù)3天進行灌喂菌液（1次/天），共進行三周，每周的灌喂時間相同

5、。每只豚鼠灌喂完畢后，間隔半小時后立即給予食物及無菌水。實驗組每只豚鼠每次灌喂3109CFU/ml的空腸彎曲菌菌懸液1ml;A組（布氏肉湯對照組）給予滅菌的布氏肉湯1ml;B組（空白對照組）不予處理。
　　4、實驗動物觀察及標(biāo)本取材
　　自灌喂當(dāng)日起每日觀察豚鼠的臨床癥狀（參考Hartley豚鼠EAN模型的評分標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)病程度分為0～5級。0級:正常;1級:兩后腳趾稍拖拽地面;2級:兩后腳趾明顯拖地;3級:兩后肢顯著拖地，兩后

6、肢偏向同一側(cè);4級:兩后肢完全癱瘓;5級:四肢均癱瘓，甚至呼吸抑制[1]），定期稱量豚鼠體重，觀察豚鼠的活動能力、精神狀況以及皮毛色澤，有無腹瀉等。
　　于末次灌喂后第1，2，3，4，5周分批解剖相應(yīng)的組別A1、B1、E1, A2、B2、E2, A3、B3、E3, A4、B4、E4, A5、B5、E5組。4％水合氯醛（10ug/g）麻醉豚鼠，灌注解剖后，分別取同側(cè)坐骨神經(jīng)近端保存于4％多聚甲醛中，擇期進行鋨酸染色觀察周圍神經(jīng)病變。

7、
　　5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
　　每個實驗標(biāo)本經(jīng)鋨酸染色后，隨機挑選100根神經(jīng)單絲，于光鏡下進行觀察，統(tǒng)計出有病變的神經(jīng)單絲個數(shù)，計算出發(fā)病率（病變單絲數(shù)/100*100％），采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0根據(jù)病變率進行x2檢驗。
　　結(jié)果：
　　1、實驗動物觀察
　　1.1臨床癥狀
　　豚鼠經(jīng)空腸彎曲菌灌喂結(jié)束后，實驗組中共有6只豚鼠發(fā)病，其中4只在灌喂結(jié)束后即刻出現(xiàn)癱瘓，2只在灌喂結(jié)束后第4周出現(xiàn)癱瘓

8、。均表現(xiàn)為活動力減弱，雙耳及唇部紫紺，呼吸急促，身體略有顫抖，雙后肢行動差，腹部皮毛臟。自發(fā)病后當(dāng)天進行麻醉豚鼠，灌注解剖取材。并將癱瘓的豚鼠合并為一組，標(biāo)記為實驗組T，根據(jù)臨床癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分均為4-5級。其它實驗組豚鼠略有脫毛現(xiàn)象，肢體活動未見明顯異常，根據(jù)臨床癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分均為0級(Fig.5)。
　　1.2體重
　　自灌喂細菌后，實驗組豚鼠體重略低于對照組，但是經(jīng)重復(fù)測量單因素方差分析后，實驗組豚鼠體重和對

9、照組無顯著差異，P＞0.05，(Fig.6)。2周圍神經(jīng)病理表現(xiàn)
　　對照組豚鼠坐骨神經(jīng)纖維也存在纖維粗細不等，皺縮等現(xiàn)象(Fig.7);
　　各實驗組中豚鼠坐骨神經(jīng)均有纖維粗細不等，髓鞘向內(nèi)側(cè)突起、節(jié)段性消失、皺縮、斷裂;髓鞘內(nèi)有卵圓狀物質(zhì)沉積，節(jié)旁區(qū)和郎飛結(jié)處多見;髓鞘外側(cè)成鋸齒樣，呈“長城樣”改變(Fig.8)。
　　3、神經(jīng)纖維病變率及統(tǒng)計分析:
　　3.1神經(jīng)纖維病變率
　　對照組豚鼠神經(jīng)單絲病理

10、存在形態(tài)上的異常，但是實驗組和對照組豚鼠周圍神經(jīng)的形態(tài)存在顯著性差異(P＜0.05)，即實驗組豚鼠的神經(jīng)單絲存在病變。
　　實驗癱瘓組豚鼠神經(jīng)病變率為42.0％，實驗組E1、E2、E3、E4、E5組病變率分別為15.3％，18.0％，29.0％，39.0％，38.7％(Table2)。
　　3.2病變率統(tǒng)計分析
　　布氏肉湯組和空白對照組豚鼠神經(jīng)纖維病變率無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05(Table3)，可排除布氏肉湯對神經(jīng)

11、纖維的影響。
　　不同時間段解剖的空白對照組及布氏肉湯組豚鼠神經(jīng)纖維病變率無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05(Table4)，可認為不同的時間段解剖豚鼠對神經(jīng)病變率無影響。
　　不同時間段解剖的實驗組豚鼠神經(jīng)纖維病變率有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05(Table5)。認為不同時間段解剖的實驗組之間發(fā)病率不全相等，進一步進行組間比較，采用x2分割法，檢驗水準(zhǔn)取α=0.05，校正后檢驗水準(zhǔn)α'=0.0033。
　　通過spss13.0曲

12、線擬合方法得出實驗組豚鼠病變率和時間存在一定的依存關(guān)系(Table6)。結(jié)合x2分割組間比較，可得出豚鼠經(jīng)活菌灌喂后第4周(E4)神經(jīng)病變率和癱瘓組(T)豚鼠神經(jīng)病變率無差異，且此兩階段神經(jīng)病變率較其它時間段解剖的實驗組高。
　　結(jié)論：
　　1、自AMAN型GBS患者糞便中分離培養(yǎng)的空腸彎曲菌經(jīng)消化道感染4周齡豚鼠能夠?qū)е码嗍笾車窠?jīng)損傷，但并不是所有的神經(jīng)單絲都有損傷，存在一定的病變率;部分豚鼠出現(xiàn)癱瘓等臨床癥狀。