豬鏈球菌2型IMPDH基因的克隆表達及相關(guān)生物學(xué)特性鑒定.pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype 2，SS<,2>)是我國豬鏈球菌病的重要病原，不僅可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡，還可感染相關(guān)人員并致死，是一種重要的人畜共患病病原。SS2可區(qū)分為強毒株、弱毒株和無毒株，已發(fā)現(xiàn)的毒力因子主要包括溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素(sLY)、New ORF2、纖維蛋白原結(jié)合蛋白(FBP)等。本實驗基于GenBank ss2

2、上述5個主要毒力因子的報道序列，分別在其上下游設(shè)計引物，應(yīng)用不同引物對進行PCR擴增測序，對毒力因子進行基因定位，發(fā)現(xiàn)上述基因均位于20kb的片段之中，在這些片段中，發(fā)現(xiàn)新的可能毒力因子次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)。該基因廣泛存在于豬鏈球菌35個血清型當(dāng)中，其中大部分為致病型，利用PCR技術(shù)將這一毒力因子擴增出目的片段構(gòu)建了含目的基因的重組表達質(zhì)粒pET-IMPDH，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)，體外表達蛋白經(jīng)鎳柱親合層析

3、純化后活性染色，證實了該蛋白的生物學(xué)活性。1 SS2 IMPDH的發(fā)現(xiàn)及生物學(xué)特性鑒定根據(jù)SS2的部分測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)位于已知毒力基因orf2與mrp之間存在兩個新的開放閱讀框序列。選取可能含有抗原決定簇肽段對應(yīng)的核酸序列，該閱讀框(2738-3694)編碼319個氨基酸殘基，分子量為33.5kD，與已知任何基因同源性較低。通過InterPro、PHD、DNAstar分析閱讀框，并定向克隆至pET-32α(+)載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL

4、21，表達出分子量為48kD的融合蛋白。該蛋白免疫轉(zhuǎn)印可被SS2的抗血清識別，具有免疫原性；并且含有IMP dehydrogenase結(jié)構(gòu)域，催化IMP生成XMP；純化蛋白作用于HEp-2細胞，流式細胞儀檢測該蛋白可明顯延長細胞的S期。2 SS2 IMPDH重組蛋白的純化和抗血清的制備 SS2 IMPDH的重組蛋白含有6個連續(xù)的組氨酸殘基，利用能與Ni<'2+>結(jié)合的特性，進行純化。IMPDH重組蛋白經(jīng)Ni-NTA His·Bind

5、Resin進行非變性條件純化后，獲得分子量為48kD的單一條帶。將上述純化的蛋白免疫新西蘭兔，獲得免疫血清，經(jīng)間接ELISA檢測，該抗血清的效價為1：3200。3 SS2 IMPDH融合蛋白其它相關(guān)生物學(xué)特性 表達SS2 IMPDH重組蛋白，進一步分析其他相關(guān)生物學(xué)功能，分別進行了細胞黏附試驗、溶血性試驗、HEp-2細胞凋亡抑制試驗、不同豬鏈球菌血清型的分布檢測及IMPDH在豬鏈球菌中的定位。結(jié)果表明，該蛋白主要位于細菌菌體內(nèi)