GH促血小板生成機(jī)制分析及dTMP-GH對(duì)輻射損傷小鼠的救治作用研究.pdf

1、隨著電離輻射在軍事、經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域中的不斷應(yīng)用,由電離輻射引起的各種損傷也在逐漸增加。骨髓是輻射敏感組織之一,當(dāng)機(jī)體受到全身或局部一定劑量射線照射后,即可引起骨髓造血功能障礙,表現(xiàn)為白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等全血細(xì)胞急劇減少,其中血小板生成減少和功能障礙是引起機(jī)體出血、感染的重要原因,也是影響機(jī)體存活和疾病預(yù)后的主要因素之一[1]。因此,促進(jìn)外周血血小板水平的快速恢復(fù)是治療輻射損傷的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前臨床上治療血小板減少癥

2、的藥物種類較少,而且大部分還存在著起效慢、副作用明顯等缺點(diǎn)。所以,尋找和研制高效、低毒的新型升血小板藥物成為一個(gè)人們迫切關(guān)注的問(wèn)題。
　　血小板來(lái)源于骨髓巨核細(xì)胞,而巨核細(xì)胞又是經(jīng)造血干細(xì)胞分化而成,因此,巨核細(xì)胞的分化過(guò)程會(huì)直接影響血小板的產(chǎn)生時(shí)間和產(chǎn)量[2]。血小板生成素(thrombopoietin, TPO)是調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞增殖、分化和血小板生成最重要的細(xì)胞因子。TPO與其受體c-Mpl結(jié)合后,激活相應(yīng)信號(hào)通路,從而刺激巨核

3、細(xì)胞的增殖、分化和血小板生成[3]。但是有文獻(xiàn)報(bào)道,一些重度血小板減少癥患者在使用重組人TPO(rhTPO)后5天左右時(shí)間外周血血小板水平才開始升高,到12天達(dá)到峰值,正因如此,患者處于血小板危象期的時(shí)間并沒(méi)有得到顯著縮短[4][5]。導(dǎo)致血小板延遲升高的原因可能與TPO不能促進(jìn)巨核細(xì)胞終末分化(包括血小板前體形成和血小板釋放)有關(guān)。更重要的是,由于能夠誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生TPO中和性抗體[6][7],美國(guó)FDA禁止了有關(guān)重組TPO基因工程藥物

4、的研發(fā)?；诖?人們轉(zhuǎn)而尋找和研制TPO的類似物和模擬物。TPO模擬肽(thrombopoietin mimetic peptide, TMP)的發(fā)現(xiàn)引起了人們的充分關(guān)注[1],雖然它僅含14個(gè)氨基酸,但其二聚體或二聯(lián)體多肽與TPO一樣都可以結(jié)合并激活TPO的受體c-Mpl,顯示出較強(qiáng)的促巨核細(xì)胞增殖與分化活性[2][3]。但是,無(wú)論是TMP二聚體還是二聯(lián)體多肽的分子量都比較小,體內(nèi)半衰期相對(duì)較短,使其體內(nèi)應(yīng)用受到限制。
　　研究

5、證實(shí),生長(zhǎng)激素(growth hormone, GH)通過(guò)與其受體GHR結(jié)合,能夠促進(jìn)不同種類細(xì)胞的增殖和/或分化[4]。有研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)缺乏GH的DW/J侏儒小鼠外周血數(shù)量(包括有白細(xì)胞,紅細(xì)胞以及血小板)顯著降低[5]。隨后有報(bào)道指出,給予放/化療或骨髓移植小鼠大劑量的GH能夠顯著促進(jìn)小鼠骨髓造血功能重建,包括血小板水平的快速恢復(fù)[6][7][8][9][10]。另外,近來(lái)一項(xiàng)臨床研究結(jié)果表明,接受化療藥物強(qiáng)化治療的血液腫瘤患者在使用

6、大劑量GH后其外周血小板水平能提前3天左右時(shí)間恢復(fù)[11]。所有的這些數(shù)據(jù)都提示GH可能在血小板生成過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,但其具體作用于血小板生成的哪個(gè)階段及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。
　　1.采用免疫磁珠分離、流式細(xì)胞分析、免疫熒光、電鏡觀察、Western blot和CCK-8本研究首先分析了GH和一種血小板生成素模擬肽二聯(lián)體(dTMP)分別對(duì)巨核細(xì)胞增殖分化、血小板前體形成以及血小板產(chǎn)生的調(diào)控作用及可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn) dTMP

7、主要作用于巨核細(xì)胞增殖分化的早期階段,而GH則主要作用于巨核細(xì)胞的終末分化階段,二者聯(lián)合具有協(xié)調(diào)促血小板生成的作用。在此基礎(chǔ)上,將GH與dTMP進(jìn)行融合,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)dTMP-GH融合蛋白的促血小板生成作用進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)而探討了dTMP-GH融合蛋白對(duì)輻射損傷所致小鼠血小板減少的救治作用。所取得的主要研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　等方法,建立了人臍血來(lái)源巨核細(xì)胞原代培養(yǎng)、巨核細(xì)胞增殖分化、血小板前體形成和血小板產(chǎn)生等一套完整的血小板生

8、成檢測(cè)與分析技術(shù)體系。
　　2.體外研究結(jié)果表明,GH不能促進(jìn)巨核祖細(xì)胞的增殖,但具有促進(jìn)巨核細(xì)胞分化的作用。
　　3.GH能夠以劑量依賴方式促進(jìn)晚期巨核細(xì)胞形成血小板前體和產(chǎn)生血小板,提示GH具有促進(jìn)巨核細(xì)胞終末分化的作用。
　　4.對(duì)于早期巨核祖細(xì)胞,GH不能激活STAT5信號(hào)通路,但能延遲和持續(xù)激活ERK1/2信號(hào)通路,給予ERK1/2信號(hào)通路阻斷劑能夠抑制GH的促巨核細(xì)胞分化作用,提示GH的促巨核細(xì)胞分化作用與

9、其激活ERK1/2的方式有關(guān)。
　　5.對(duì)于晚期成熟巨核細(xì)胞,GH具有快速激活A(yù)kt信號(hào)通路的作用,并且能夠增強(qiáng)Rho激酶Cdc42和Rac1的活性,給予Akt和Rho信號(hào)通路阻斷劑可以抑制GH的促血小板前體形成和血小板生成作用,提示GH通過(guò)激活A(yù)kt/Rho信號(hào)通路而發(fā)揮促進(jìn)巨核細(xì)胞終末分化的功能。
　　6.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)dTMP能夠以劑量依賴方式促進(jìn)巨核祖細(xì)胞的增殖與分化,但對(duì)血小板前體形成和產(chǎn)板卻具有抑制作用,說(shuō)明dTM

10、P主要通過(guò)促進(jìn)早期巨核細(xì)胞的增殖與分化而發(fā)揮促血小板生成作用。
　　7.與單獨(dú)dTMP相比,dTMP與GH聯(lián)合應(yīng)用能顯著促進(jìn)血小板前體形成、加速血小板生成與釋放,同時(shí)伴有β1-tubulin表達(dá)增強(qiáng)、巨核細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)形成,提示GH與dTMP在血小板生成方面具有互補(bǔ)作用。
　　8.dTMP-GH融合蛋白可以顯著促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖與分化,且其作用顯著優(yōu)于單純dTMP以及dTMP+GH處理組,提示通過(guò)與GH融合可以提高dTMP的促巨

11、核細(xì)胞增殖分化能力,其機(jī)制可能與蛋白空間構(gòu)象改變或受體介導(dǎo)信號(hào)通路的交叉激活有關(guān)。
　　9.dTMP-GH融合蛋白能夠顯著上調(diào)巨核細(xì)胞GATA-1、NF-E2及β1-tubulin的表達(dá);與單純 dTMP處理組相比,dTMP-GH融合蛋白處理組血小板前體形成和血小板產(chǎn)生時(shí)間提前,數(shù)量增多。
　　10.Western blot結(jié)果表明,dTMP-GH不僅能夠快速激活巨核祖細(xì)胞中STAT5信號(hào)通路,而且還能持續(xù)活化ERK1/2信

12、號(hào)通路,同時(shí)還具有激活晚期巨核細(xì)胞Akt的能力,從信號(hào)通路激活角度進(jìn)一步證實(shí)dTMP-GH同時(shí)具有促進(jìn)早期巨核細(xì)胞增殖分化和晚期巨核細(xì)胞成熟和產(chǎn)板的活性。
　　11.成功復(fù)制急性輻射損傷小鼠血小板減少癥動(dòng)物模型,與生理鹽水對(duì)照組和dTMP處理組相比,給予dTMP-GH融合蛋白處理能夠加速受照小鼠血小板水平恢復(fù),顯著升高受照小鼠外周血小板最低值水平,縮短血小板處于低谷期時(shí)間,并顯著提高小鼠存活率,提示dTMP-GH對(duì)急性輻射損傷所致

13、血小板減少具有突出的救治作用。
　　12.dTMP-GH融合蛋白對(duì)卡鉑化療及放療聯(lián)合化療所致小鼠血小板減少也具有顯著的救治作用,不僅可以促進(jìn)血小板水平快速恢復(fù),而且還可顯著降低小鼠死亡率。
　　總之,通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究我們首次發(fā)現(xiàn)GH具有促進(jìn)巨核細(xì)胞終末分化、加速血小板前體形成和血小板產(chǎn)生的作用,并初步闡明了其作用機(jī)理;同時(shí),發(fā)現(xiàn)GH與dTMP具有協(xié)同促血小板生成的作用,并證實(shí)dTMP-GH重組融合蛋白同時(shí)具有促進(jìn)早期巨核細(xì)胞增