Annexin Ⅱ在多發(fā)性骨髓瘤及其他血液腫瘤中的表達及機制研究.pdf

1、Annexins蛋白是一類受Ca2+調(diào)節(jié)、能夠與帶負電荷的膜磷脂結(jié)合的蛋白家族，在許多原核和真核細胞中廣泛表達。Annexin II(AnxA2，A2)作為Annexin家族的重要成員，于1979年被Rade和Martin首先發(fā)現(xiàn)。AnxA2多表達于內(nèi)皮細胞、單核巨噬細胞、神經(jīng)細胞和某些腫瘤細胞，在細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核和胞外均有表達。AnxA2蛋白在細胞內(nèi)以單體和異四聚體兩種形式存在。AnxA2單體由保守的C端和可變的N端組成，可與蛋

2、白質(zhì)配體P11蛋白(又名S100A10)形成異四聚體，執(zhí)行其與生物膜結(jié)構(gòu)相關(guān)的一系列功能。 AnxA2蛋白參與了眾多生物學活動，在細胞膜構(gòu)架的形成，膜聚合、內(nèi)吞和胞吐，纖溶系統(tǒng)的穩(wěn)定等生理活動中均扮演重要角色。AnxA2還參與某些病理過程，與心血管疾病、血液病、感染、腫瘤等多種疾病相關(guān)。無論在胞內(nèi)還是胞外，AnxA2都具有廣泛的功能，對其的研究也受到越來越多的關(guān)注。 一、AnxA2單抗的制備及功能研究 研究表明

3、AnxA2的胞外區(qū)是t-PA和plasminagen的共受體，在纖溶活性的誘導過程中起重要作用，并是多種病毒、炎癥介質(zhì)的受體，在病毒感染，炎癥活動中起一定作用，因此，制備針對AnxA2的胞外區(qū)的單克隆抗體對研究AnxA2在各種生理病理狀態(tài)下的功能具有重要意義。 利用本科室已經(jīng)建立起來的雜交瘤技術(shù)，將重組AnxA2蛋白經(jīng)次氮基三乙酸鎳瓊脂糖(Ni-NTAagarose)柱純化濃縮后免疫Balb/c小鼠，尾靜脈加強后取脾細胞融合，E

4、LISA法篩選陽性克隆，制備腹水。運用Western blot對抗體進行鑒定觀察抗體與原核重組蛋白反應情況。結(jié)果可以看出：小鼠脾細胞與雜交瘤細胞融合后篩選獲得兩株持續(xù)分泌單克隆抗體的細胞株，命名為SZ-135，SZ-136。該株雜交瘤細胞單克隆后接種小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，腹水經(jīng)蛋白G-Sephrose4B親和層析柱純化。SZ-135，SZ-136單抗能特異性識別相對分子量為36kD的重組蛋白。同時SZ-135可以有效抑制HMEC-1體外的血

5、管形成。 二、AnxA2在多發(fā)性骨髓瘤及各類血液病中的異常表達及機制研究 1．AnxA2在多發(fā)性骨髓瘤及各類血液病中的異常表達 AnxA2表達異常與人類許多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在多種類型的腫瘤中都可觀察到AnxA2的表達異常。國外近年的研究表明，AnxA2在APL細胞膜表面的高表達與其原發(fā)性纖溶亢進有關(guān)，但在MM及其它類型的血液病中的表達卻少有報道。 在實驗中，通過應用流式細胞儀檢測了6例骨髓瘤病人和6

6、例正常人漿細胞表面AnxA2表達，明確了骨髓瘤病人漿細胞表面AnxA2表達明顯高于正常人。通過real-time PCR、Western blot、流式細胞儀檢測U266和NB4、RPMI8226、XG7、Jurkat、Rajli、12937、K562共8類血液病細胞株AnxA2表達，明確了骨髓瘤細胞株U266在mRNA、總蛋白、膜表面蛋白不同水平均較其它血液病細胞株高表達AnxA2。骨髓瘤細胞株RPM18226在總蛋白水平亦高表達An

7、xA2。 2．AnxA2基因?qū)撬枇鯱266、RPMI8226細胞增殖、凋亡、侵襲力及細胞因子的影響 為了了解AnxA2基因?qū)撬枇鯱266、RPMI8226細胞增殖、凋亡、侵襲力及細胞因子的影響，應用RNAi技術(shù)進行研究。首先，采用siRNA轉(zhuǎn)染人骨髓瘤U266、RPMI8226細胞，應用real-time PCR、Western blot和流式細胞術(shù)鑒定干擾效果。繼而應用MTT法檢測siRNA對細胞增殖的作用，應用A

8、nnexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測其對細胞凋亡的影響，應用Transwell板檢測細胞侵襲力，應用real-time PCR檢測對血管新生、凋亡、侵襲等相關(guān)基因的影響。結(jié)果表明，AnxA2siRNA轉(zhuǎn)染U266和RPMI8226細胞均對細胞增殖起抑制作用，并可誘導細胞凋亡增加，明顯降低細胞侵襲力，同時降低血管新生相關(guān)因子VEGF-C、VEGF-R2，侵襲相關(guān)因子MMP-2、MMP-9、MT1-MMP和TIMP-2的表達。

9、由此認為：siRNA沉默AnxA2基因可抑制U266和RPMI8226細胞增殖、侵襲，誘導凋亡增加，降低血管新生、侵襲相關(guān)因子的表達。 三、各類藥物對血液病細胞株AnxA2表達的影響 1．AnxA2與沙利度胺、地塞米松誘導骨髓瘤病人血栓形成的相關(guān)性 為了了解沙利度胺(thalidomide)、地塞米松(DXM)在體外對人多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞株RPMI8226、人微血管內(nèi)皮細胞株HMEC-1、人靜脈內(nèi)皮細胞株E

10、AHY926中AnxA2基因表達的調(diào)節(jié)作用，探討AnxA2基因與沙利度胺、地塞米松誘發(fā)骨髓瘤病人血栓形成的相關(guān)性。在體外培養(yǎng)上述細胞，real time PCR檢測在不同濃度下沙利度胺及地塞米松對三種細胞株AnxA2基因表達的影響，流式細胞儀、激光共聚焦檢測對三種細胞株膜表面AnxA2蛋白表達的影響，細胞促纖溶活性實驗檢測對三種細胞株膜表面纖溶酶活性的影響。結(jié)果表明，12．5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml沙利度胺，2．5μg

11、/ml地塞米松，25μg/ml沙利度胺加2．5μg/ml地塞米松均能誘導RPMI8226、HMEC-1、Eahy926細胞株AnxA2mRNA和蛋白表達下降。AnxA2抗體、12．5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml沙利度胺，2．5μg/ml地塞米松，25μg/ml沙利度胺加2．5μg/ml地塞米松均能誘導RPMI8226、HMEC-1、Eahy926細胞株纖溶活性下降，差異有統(tǒng)計學意義。故認為，沙利度胺和地塞米松能抑制RPMI

12、8226、HMEC-1、Eahy926細胞株AnxA2mRNA和蛋白表達。由于AnxA2為t-PA和PLA的共受體，具促纖溶作用，沙利度胺和地塞米松通過下調(diào)AnxA2，抗纖溶，可能為其誘發(fā)MM血栓形成的原因之一。 2．AS2O3通過下調(diào)AnxA2抑制NB4細胞侵襲力 為了研究三氧化二砷(AS2O3)是否可通過下調(diào)AnxA2抑制人急性早幼粒白血病細胞(NB4)侵襲力的作用。在體外培養(yǎng)NB4細胞，并通過流式細胞儀檢測不同濃度

13、AS2O3對NB4細胞膜表面AnxA2蛋白表達的影響，Transwell板檢測AnxA2抗體和AS2O3對NB4細胞侵襲力的影響。結(jié)果表明AS2O3在0．31μg/ml，0．63μg/ml，1．25μg/ml濃度均能誘導NB4細胞膜表面AnxA2蛋白水平表達下降，存在劑量依賴性；AnxA2抗體在0．01μg/ml，0．02μg/ml，0．04μg/ml濃度和AS2O3在0．31μg/ml，0．63μg/ml，1．25μg/ml濃度均抑制