哌侖西平滴眼劑的研制及其抑制豚鼠形覺(jué)剝奪性近視的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近視眼是全球發(fā)病率最高的眼病之一，但到目前為止還沒(méi)有一種安全有效的近視防治藥物。阿托品是唯一獲得公認(rèn)的有效藥物，但由于其明顯的副作用，臨床上難以推廣。近視的發(fā)生與眼軸延長(zhǎng)和眼球擴(kuò)大密切相關(guān)。近期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)球內(nèi)或者球周注射選擇性Ml受體拮抗劑哌侖西平(pirenzepine，以下簡(jiǎn)稱PIR)能夠明顯抑制實(shí)驗(yàn)性近視的發(fā)生和發(fā)展，并且安全無(wú)毒：但是有創(chuàng)傷性的給藥方式不利于長(zhǎng)期用藥。所以開(kāi)發(fā)無(wú)創(chuàng)性的給藥方式和制劑十分迫切。本課題對(duì)自行研發(fā)的

2、哌侖西平滴眼劑的藥品質(zhì)量、藥物療效和治療機(jī)制等方面進(jìn)行研究，為哌侖西平滴眼劑的臨床使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。 第一部分 【目的】考察哌侖西平滴眼劑的雜質(zhì)含量、藥物穩(wěn)定性和眼部耐受性。 【方法】抽取三個(gè)批號(hào)的2％哌侖西平滴眼劑，使用高效液相色譜法測(cè)定其中的雜質(zhì)含量。另抽取三個(gè)批號(hào)的2％哌侖西平滴眼劑，分別進(jìn)行40℃加速實(shí)驗(yàn)和25℃室溫長(zhǎng)期留置實(shí)驗(yàn)，考察哌侖西平滴眼劑的放置穩(wěn)定性。眼部刺激性試驗(yàn)取新西蘭白兔，隨機(jī)分成四

3、組，實(shí)驗(yàn)眼分別給予1％，2％，4％和8％PIR滴眼液點(diǎn)眼，對(duì)照眼給予0.9％氯化鈉溶液點(diǎn)眼。根據(jù)藥物試驗(yàn)要求分別觀察不同給藥周期后雙眼的眼瞼、結(jié)膜、角膜和虹膜情況，根據(jù)Draize評(píng)分表的標(biāo)準(zhǔn)打分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘除眼球作組織切片，光鏡檢查。致敏性試驗(yàn)取豚鼠先行背部脫毛，而后將受試藥物(2％PIR)、賦形劑和陽(yáng)性對(duì)照藥物(2，4-二硝基氯代苯)涂于脫毛區(qū)并給予適當(dāng)固定，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察受試區(qū)皮膚的水腫和紅斑情況并進(jìn)行評(píng)分。毒性實(shí)驗(yàn)取連續(xù)用藥

4、(分別給予2％PIR或0.9％氯化鈉溶液)四周后的動(dòng)物眼球，進(jìn)行病理檢查。所有試驗(yàn)均使用盲法。 【結(jié)果】所檢測(cè)的2％哌侖西平滴眼劑的雜質(zhì)含量符合標(biāo)準(zhǔn)。2％哌侖西平滴眼劑的加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)合格；長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2％哌侖西平在常溫下放置超過(guò)6個(gè)月出現(xiàn)溶液變色等穩(wěn)定性下降的表現(xiàn)。刺激性試驗(yàn)結(jié)果表明，1％和2％PIR溶液的刺激性較小，眼部耐受性較好；4％和8％PIR溶液的重復(fù)和長(zhǎng)期給藥刺激性較大，耐受性差。致敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PI

5、R滴眼劑為弱致敏性。病理檢查顯示，2％PIR滴眼劑對(duì)眼部各個(gè)組織沒(méi)有明顯的毒性反應(yīng)。【結(jié)論】2％哌侖西平滴眼劑的藥品標(biāo)示含量、雜質(zhì)含量等指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)；建議常溫、常濕下保存時(shí)間不超過(guò)6個(gè)月。1％和2％哌侖西平滴眼劑的眼部刺激性小，耐受性較好：2％哌侖西平滴眼劑致敏性低，對(duì)眼部組織沒(méi)有明顯的毒性作用。 第二部分【目的】研究哌侖西平滴眼劑能否抑制豚鼠形覺(jué)剝奪性近視眼的進(jìn)展：并探討哌侖西平對(duì)M<,1>和M<,4>亞型乙酰膽堿受體表達(dá)的

6、影響。 【方法】藥效學(xué)研究選取三周齡豚鼠66只，右眼眼瞼縫合建立形覺(jué)剝奪性近視模型。建模動(dòng)物隨機(jī)分為六組：其中三組分別給予1％、2％和4％PIR滴眼；一組給予1％阿托品溶液滴眼，作為陽(yáng)性對(duì)照：一組給予0.9％氯化鈉溶液滴眼，作為陰性對(duì)照；一組不給任何藥物，作為空白對(duì)照。通過(guò)形覺(jué)剝奪眼的屈光度數(shù)變化、眼軸長(zhǎng)度以及眼球濕重評(píng)價(jià)哌侖西平的治療效果。另取三周齡豚鼠32只，隨機(jī)分為4組，其中兩組單眼眼瞼縫合建立形覺(jué)剝奪性近視模型，另兩組雙

7、眼均開(kāi)放。一組形覺(jué)剝奪組和一組雙眼開(kāi)放組，給予哌侖西平0.1ml球周注射(含鹽酸哌侖西平5mg)，每天一次，連續(xù)兩周；另一組形覺(jué)剝奪組和雙眼開(kāi)放組，均給予0.9％生理鹽水0.1ml球周注射，注射頻率與哌侖西平組相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)RT-PCR對(duì)各組鞏膜、脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)M<,1>和M<,4>亞型受體的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用免疫熒光法檢測(cè)兩種受體在各個(gè)組織中的表達(dá)情況。 【結(jié)果】(1)右眼遮蓋四周后，未處理組和0.9％氯

8、化鈉溶液滴眼組動(dòng)物的遮蓋眼分別平均誘導(dǎo)出-2.31D和-2.25D相對(duì)近視。1％、2％和4％哌侖西平溶液滴眼組的遮蓋眼分別出現(xiàn)-1.63D、-0.89D和-0.70D相對(duì)近視，1％阿托品溶液滴眼組的遮蓋眼出現(xiàn)-0.31D相對(duì)近視。與1％阿托品滴眼組相比，2％哌侖西平滴眼組和4％哌侖西平滴眼組在實(shí)驗(yàn)前后遮蓋眼的屈光度變化沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是另外三組在實(shí)驗(yàn)前后遮蓋眼的屈光度變化均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.56，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)眼經(jīng)遮

9、蓋4周后，未處理組、0.9％氯化鈉溶液滴眼組和1％哌侖西平溶液滴眼組的玻璃體腔深度及眼軸長(zhǎng)度較實(shí)驗(yàn)前明顯延長(zhǎng)，分別為0.057±0.056mm，0.064±0.053mm和0.033±0.035mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。遮蓋四周后，未處理組和0.9％氯化鈉溶液滴眼組的眼球濕重明顯高于其他組。(2)四個(gè)組別的視網(wǎng)膜色素上皮層、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和鞏膜，與Ml受體的抗體均呈不同程度的陽(yáng)性反應(yīng)；內(nèi)核層和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層染色

10、呈弱陽(yáng)性。然而，MD—S組的視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜的M<,1>受體表達(dá)水平均明顯高于其他三組 (F=9.005，7.26，10.43，P均<0.05)。單眼形覺(jué)剝奪組的脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)Ml受體的mRNA水平顯著高于雙眼開(kāi)放的兩組(F值分別為6.23和7.23，P均<0.05)。MD—S組鞏膜內(nèi)的M<,1>受體mRNA水平明顯高于其他三組(F=7.97，P<0.05)。四個(gè)組別中，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和鞏膜的M<,4>受體的染色結(jié)果均呈陽(yáng)

11、性；但是MD—P組視網(wǎng)膜組織的平均熒光強(qiáng)度顯著弱于其他三組(F=5.156，P<0.05)。MD—P組鞏膜和視網(wǎng)膜內(nèi)的M<,4>受體mRNA水平顯著低于其他三組(F=12.33，4.02，P均<0.05) 【結(jié)論】2％和4％哌侖西平滴眼液能夠有效抑制豚鼠形覺(jué)剝奪性近視的發(fā)展，2％是比較理想的制劑濃度。在豚鼠形覺(jué)剝奪性近視模型中，M<,1>受體的表達(dá)水平上調(diào)，且升高幅度遠(yuǎn)高于M<,4>受體。哌侖西平通過(guò)阻斷M<,1>受體，阻滯豚鼠