甘油醛后鞏膜交聯(lián)治療豚鼠形覺剝奪性近視的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：病理性近視(Pathologic myopia，PM)是成年人重要的致盲性眼病之一，目前尚無良好治療對(duì)策。近視發(fā)病機(jī)制的研究提示:鞏膜是各種致病因素作用的主要靶器官，鞏膜病理性的薄弱是PM作用的結(jié)果，也是導(dǎo)致其它相關(guān)病變的誘因，而針對(duì)鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度變化的干預(yù)有可能是阻斷PM進(jìn)展的一條可行途徑。本研究通過建立豚鼠形覺剝奪性近視(form deprivation myopia，F(xiàn)DM)模型，應(yīng)用甘油醛促進(jìn)鞏膜交聯(lián)，探討甘油醛對(duì)鞏膜生

2、物力學(xué)特征的影響及其對(duì)實(shí)驗(yàn)性近視的抑制作用，從控制鞏膜重塑并增加其強(qiáng)度的角度，為防治PM提供新思路。
　　 方法：⑴甘油醛對(duì)離體鞏膜條帶的交聯(lián)作用:選用15只三周齡三色豚鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組，每組5只。均取右眼為實(shí)驗(yàn)眼。矢狀位取2mm×6mm的鞏膜條帶，給予0.005mol/L甘油醛組，0.05mol/L甘油醛組和空白對(duì)照液室溫下浸泡4天。應(yīng)用微材料力學(xué)性能測(cè)試系統(tǒng)，對(duì)各組鞏膜條帶的極限應(yīng)力σmax(MPa)、極限應(yīng)變?chǔ)舖

3、ax(％)、6％彈性模量E(MPs)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。⑵豚鼠FDM模型的建立:用6號(hào)乳白色半透明乳膠氣球，依照豚鼠頭部形狀剪制成頭套，暴露出動(dòng)物的左眼，雙耳及口鼻。制作動(dòng)物右眼形覺剝奪模型。室溫下飼養(yǎng)，正常晝夜節(jié)律。分別于實(shí)驗(yàn)開始前、形覺剝奪7、14、21天時(shí)測(cè)量眼軸長(zhǎng)度、玻璃體腔長(zhǎng)度及屈光度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。⑶甘油醛后鞏膜交聯(lián):選用35只三周齡三色豚鼠，將動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，每組7只，右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為對(duì)照眼。A組:右眼遮蓋7天

4、;B組:右眼遮蓋21天，0.9％生理鹽水第1、8、15天Tenon's囊下球后注射;C組:右眼遮蓋21天，0.05mol/L甘油醛第1、8、15天Tenon's囊下球后注射;D組:右眼遮蓋21天，0.5mol/L甘油醛第1、8、15天Tenon's囊下球后注射;E組:正常對(duì)照組。并于實(shí)驗(yàn)開始前、形覺剝奪7、14、21天時(shí)測(cè)量眼軸長(zhǎng)度、玻璃體腔長(zhǎng)度及屈光度。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)用微材料力學(xué)性能測(cè)試系統(tǒng)測(cè)量5個(gè)組鞏膜的極限應(yīng)力σmax(MPa)

5、、極限應(yīng)變?chǔ)舖ax(％)、6％彈性模量E(MPa)，并與對(duì)側(cè)眼比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。繪制5個(gè)組的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，比較甘油醛交聯(lián)對(duì)豚鼠鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度的影響。⑷后鞏膜交聯(lián)術(shù)對(duì)豚鼠FDM眼超微結(jié)構(gòu)影響的觀察:選用18只三周齡三色豚鼠，隨機(jī)抽取其中的15只豚鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組。右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為對(duì)照眼。實(shí)驗(yàn)方法同3。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死豚鼠，在視神經(jīng)顳側(cè)連續(xù)切取5片組織，厚度0.5μm，2片行蘇木精-伊紅染色，3片行免疫組化染色，檢測(cè)后極

6、部鞏膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜MMP-2表達(dá)，光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。余下的3只豚鼠給予0.5mol/L的甘油醛Tenon's囊下球后注射，分別在第3、7、14天處死。取注射相鄰部位的角膜緣、眼外肌和視神經(jīng)篩板做切片，行蘇木精-伊紅染色。判斷甘油醛對(duì)視網(wǎng)膜、視神經(jīng)是否有毒性。
　　 結(jié)果：①離體鞏膜實(shí)驗(yàn):不同濃度甘油醛組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)眼鞏膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線有明顯的梯度變化?？瞻讓?duì)照組鞏膜的極限應(yīng)力σmax、極限應(yīng)變?chǔ)舖ax、6％彈性模量E

7、分別為（7.198±0.991）MPa、（21.480±0.853）％和（22.808±2.159）MPa。甘油醛交聯(lián)組中，6％彈性模量E0.005 mol/L甘油醛組、0.05 mo/L甘油醛組分別為（25.903±0.892）MPa(P=0.019)和（36.156±2.026）MPa(P=0.000)，較空白對(duì)照組分別增加了13.57％和58.52％。0.005 mol/L甘油醛組、0.05 mo/L甘油醛極限應(yīng)力σmax分別為（

8、10.386±1.023）MPa(P=0.0012)和（14.851±1.602）MPa(P=0.000)，較空白對(duì)照組分別增加了44.30％和106.32％;0.005 mol/L甘油醛組、0.05 mo/L甘油醛組極限應(yīng)變?chǔ)舖ax分別為(19.320±0.672)％(P=0.002)和（14.140±1.001）％(P=0.000)，較空白對(duì)照組分別降低10.06％和34.17％。②形覺剝奪后，實(shí)驗(yàn)眼均出現(xiàn)了玻璃體腔長(zhǎng)度和眼軸長(zhǎng)度的

9、增加以及相對(duì)近視度數(shù)的增加，在A組、B組和C組中，玻璃體腔長(zhǎng)度、眼軸長(zhǎng)度和屈光度與對(duì)側(cè)眼相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P玻璃體腔=0.018，0.002，0.001;P眼軸=0.019，0.002，0.000;P屈光=0.000，0.005，0.001）。D組、E組玻璃體腔長(zhǎng)度、眼軸長(zhǎng)度與對(duì)側(cè)眼相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P玻璃體腔=0.607，0.539;P眼軸=0.607，0.539）D組實(shí)驗(yàn)眼與對(duì)側(cè)眼屈光度相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P屈光=0.

10、020)。③在實(shí)驗(yàn)第21天結(jié)束時(shí)，B、C、D、E組實(shí)驗(yàn)眼的屈光度變化值分別為(8.800±0.616)D，(7.236±2.198)D，(6.271±1.112)D和(0.934±0.158)D，總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.249，P=0.000)，B、C、D組的屈光度變化值較正常對(duì)照組大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PB=0.000，PC=0.000，PD=0.000); B、C、D組的眼軸變化值較正常對(duì)照組大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PB=0

11、.430，PC=0.840，PD=0.386)。④在實(shí)驗(yàn)第21天結(jié)束時(shí)，B組和E組對(duì)側(cè)眼比較，B組玻璃體腔長(zhǎng)度的增加值為(0.198±0.038)mm，E組為(0.139±0.026)mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.689，P=0.002）;B組眼軸長(zhǎng)度的增加值為（0.481±0.062）mm，E組為（0.438±0.068）mm，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.295，P=0.216）。⑤B組實(shí)驗(yàn)眼眼軸長(zhǎng)度與屈光呈高度負(fù)相關(guān)（r=-0.

12、832，P=0.000）;B組實(shí)驗(yàn)眼玻璃體腔長(zhǎng)度與屈光度呈高度負(fù)相關(guān)（r=-0.804，P=0.000）;E組右眼的眼軸長(zhǎng)度和屈光度呈中度負(fù)相關(guān)（r=-0.604，P=0.000）;E組雙眼的眼軸長(zhǎng)度呈高度相關(guān)（r=0.940，P=0.000）。⑥試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，B組實(shí)驗(yàn)眼的極限應(yīng)力和6％彈性模量分別為（7.988±3.677）MPa(P=0.002)和（19.938±4.871）MPa(P=0.001)，較對(duì)側(cè)眼分別降低了34.21％和3

13、4.38％，極限應(yīng)變實(shí)驗(yàn)眼為（28.6±3.6）％(P=0.034)，較對(duì)側(cè)眼增加了19.17％。甘油醛交聯(lián)后，C組實(shí)驗(yàn)眼的極限應(yīng)力和6％彈性模量分別為（9.244±0.806）MPa(P=0.001)和（26.180±4.388）MPa(P=0.031)，較對(duì)側(cè)眼分別降低了23.13％和13.34％，極限應(yīng)變實(shí)驗(yàn)眼為（26.2±1.0）％(P=0.016)，較對(duì)側(cè)眼增加了12.93％;D組實(shí)驗(yàn)眼的極限應(yīng)力為（12.476±2.507）

14、MPa(P=0.580)，較對(duì)側(cè)眼降低了5.50％，6％彈性模量為（30.446±3.410）MPa(P=0.314)，較對(duì)側(cè)眼增加了6.53％，極限應(yīng)變?yōu)椋?3.8±1.8）％(P=0.253)，較對(duì)側(cè)眼降低了4.42％。在D組(0.5 mol/L甘油醛)攻膜交聯(lián)21天后與B組的實(shí)驗(yàn)眼相比，鞏膜的極限應(yīng)力增加了35.85％，6％彈性模量增加了52.70％，極限應(yīng)變降低了16.78％。不同濃度甘油醛交聯(lián)與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)眼的應(yīng)力-應(yīng)變曲線有明

15、顯的梯度變化，D組的應(yīng)力-應(yīng)變曲線接近正常對(duì)照組，高于其它3組。⑦組織學(xué)檢查:隨著豚鼠FDM的出現(xiàn)，表現(xiàn)為眼外組織疏松，鞏膜厚度明顯降低，纖維排列整齊，脈絡(luò)膜厚度降低，可見血管腔，但未見大的竇腔，視網(wǎng)膜層次清晰。MMP-2在眼球表層結(jié)締組織、鞏膜表層結(jié)締組織、淺層鞏膜、脈絡(luò)膜實(shí)質(zhì)層以及視網(wǎng)膜外叢狀層陽(yáng)性表達(dá)比正常對(duì)照眼明顯。甘油醛交聯(lián)后出現(xiàn)了眼球表面結(jié)締組織結(jié)構(gòu)變得相對(duì)致密，排列有序，與鞏膜連接緊密。鞏膜組織的厚度變薄，細(xì)胞密度增加。脈

16、絡(luò)膜管腔擴(kuò)大，厚度變化不明顯。視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞核清晰，排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。MMP-2在除眼表結(jié)締組織外的鞏膜表面結(jié)締組織，淺層鞏膜、脈絡(luò)膜實(shí)質(zhì)層以及視網(wǎng)膜外叢狀層的陽(yáng)性表達(dá)明顯降低。
　　 結(jié)論：⑴甘油醛是一種安全有效的交聯(lián)劑，能夠顯著增強(qiáng)鞏膜的生物力學(xué)強(qiáng)度。⑵頭套法形覺剝奪成功誘導(dǎo)出以豚鼠為對(duì)象的動(dòng)物近視模型，而且這種近視是以眼軸延長(zhǎng)特別是玻璃體腔長(zhǎng)度增加為主的軸性近視。⑶隨著眼軸的延長(zhǎng)及近視度數(shù)的加深，鞏膜的生物力學(xué)