牙齦卟啉單胞菌毒力島PG0839基因功能研究.pdf

1、病原菌毒力島是指編碼細菌毒力基因簇的分子量較大的染色體DNA片段。通過基因水平轉(zhuǎn)移，細菌獲得毒力島基因。毒力島編碼不同功能的毒力相關(guān)基因，影響細菌的毒力變化。毒力島的轉(zhuǎn)移對宿主菌的致病能力或性狀改變顯著，且與細菌進化和新病原菌出現(xiàn)有關(guān)。PG0839基因是牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)W83菌株P(guān)G0819-0844毒力島中的重要部分。在慢性牙周炎患者 P.gingivalis陽

2、性的齦下菌斑標本中，毒力島基因PG0839檢出與牙周探診深度和探診出血指數(shù)之間存在統(tǒng)計學意義，提示該基因可能是慢性牙周炎的致病性基因。目前許多學者通過反向遺傳學方法進行基因功能研究，即構(gòu)建目的基因敲除菌株后，通過對突變株表型變化的研究，獲得目的基因與細菌表型之間的相關(guān)性，從而獲知基因的功能。本研究擬遵循反向遺傳技術(shù)路線，運用等位基因重組技術(shù)構(gòu)建P.gingivalis PG0839基因突變菌株P(guān).gingivalis W83-PG083

3、9，并通過PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR對突變株進行檢測驗證。同時，針對P.gingivalis W83-PG0839菌株的生物學特性以及PG0839基因毒力進行研究，為進一步明確毒力島基因PG0839的功能提供實驗依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、主要試劑、儀器BHI培養(yǎng)基(Difco Laboratories，美國)天凈沙細菌RNA OUT試劑盒(天澤基因工程有限公司)PrimeSTAR HS

4、DNA Polymerase，DNA片段純化試劑盒，DL2000 DNAMarker，λ-HindⅢDNA Marker，質(zhì)粒小量提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，引物(大連寶生物工程有限公司)PCR擴增儀(TGRADIENT，Biometra公司，德國)自動凝膠成像分析儀(GDS8000，UVP公司，美國)厭氧培養(yǎng)箱(LY-Ⅰ型，沈陽醫(yī)療器械研究所)電穿孔儀(ECM630，BTX公司，美國)2、實驗菌株本次研究采用了5種菌株：P.gi

5、ngivalis ATCC33277、P.gingivalis W83、P。gingivalis W83-PG0839、大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)JM109和變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)ATCC2517。
　　 p.gingivalis W83由美國佛羅里達大學牙科學院口腔微生物研究所LamontRJ教授惠贈，P.gingivalis ATCC33277

6、和S.mutans ATCC2517由首都醫(yī)科大學口腔醫(yī)院提供，P.gingivalis W83-PG0839菌株由本次實驗構(gòu)建，E.coli JM109購自大連寶生物工程有限公司。
　　 二、實驗方法
　　 1、受試對象和受試位點的選擇選取2005年2月至2006年11月在中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院牙周科門診就診慢性牙周炎患者90例。每例患者隨機選取3個受試位點，共有259顆牙的270個受試位點納入本研究。
　　

7、2、齦下菌斑樣本的采集記錄受試位點的牙周探診深度(probing depth，PD)、臨床附著喪失(clinicalattachment loss，CAL)和探診出血(bleeding on probing，BOP)情況。去除受試牙的齦上菌斑，棉卷隔濕。用無菌牙簽取適量齦下菌斑，1 ml無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)保存。
　　 3、齦下菌斑樣本的P.gingivalis檢測應(yīng)用

8、P.gingivalis16S rRNA特異性引物序列進行PCR擴增，預(yù)期產(chǎn)物片段長度為197 bp。
　　 4、P.gingivalis陽性標本的PG0836、PG0838和PG0839基因的檢測設(shè)計PG0836、PG0838和PG0839基因特異性引物，對P.gingivalis陽性標本PCR擴增后，預(yù)期產(chǎn)物片段長度分別為249 bp、331 bp和134 bp。
　　 5、突變株構(gòu)建(1)細菌培養(yǎng)P.gingiva

9、lis W83菌株接種于新鮮配制的含5％無菌脫纖維羊血，1%氯化血紅素和維生素K(0.5μg/ml)的腦心浸液培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI)，37℃厭氧培養(yǎng)5-7天。E.coli JM109菌株接種于Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，37℃需氧培養(yǎng)。
　　 (2)pPG0839-1質(zhì)粒構(gòu)建設(shè)計PG0839基因特異性引物，擴增PG0839基因片段。預(yù)期產(chǎn)物片段為1584 bp，包含PG0839全

10、長基因和部分上游和下游的非編碼DNA片段。對PCR產(chǎn)物和pUC19載體進行BamIHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收、連接酶切產(chǎn)物后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細胞。氨芐青霉素(ampicillin，Amp)抗性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，增菌，提取質(zhì)粒pPG0839-1A，測序。測序結(jié)果顯示pPG0839-1A基因編碼區(qū)內(nèi)存在1點突變。委托寶生物公司進行點突變修復(fù)后測序，結(jié)果顯示基因編碼區(qū)與參考序列一致，將該質(zhì)粒命名為pPG0839-1

11、。
　　 (3)紅霉素抗性基因(erythromycin，erm)擴增使用erm特異性引物對質(zhì)粒pVA9812 DNA進行PCR擴增，預(yù)期產(chǎn)物片段為2101 bp。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物?；厥誔CR產(chǎn)物，加“A”，純化。將精制后的PCR產(chǎn)物和pMD19-T simple載體連接，熱轉(zhuǎn)化至E.coli JM109，涂布平板。使用菌落PCR篩選陽性克隆后，增菌提取質(zhì)粒pErm DNA，測序。使用StuⅠ對質(zhì)粒pErm進行酶

12、切后，回收純化得到2101 bp erm基因片段。
　　 (4)pPG0839-2質(zhì)粒構(gòu)建使用EcoR V對質(zhì)粒pPG0839-1進行酶切后，凝膠回收得到pPG0839-1-EcoR V片段。將純化酶切產(chǎn)物進行去磷酸化處理后，凝膠回收得到3.7 kb的pPG0839-1-EcoR V(BAP)片段。連接pPG0839-1-EcoR V(BAP)和erm基因片段，熱轉(zhuǎn)化至E.coli JM109，Amp抗性培養(yǎng)基篩選陽性克隆后，增

13、菌提取質(zhì)粒DNA，HindⅢ進行正反向酶切鑒定，測序，將質(zhì)粒命名為pPG0839-2。
　　 (5)載體電穿孔轉(zhuǎn)化及突變株篩選將100μl P.gingivalis細胞懸液和1μgpPG0839-2 DNA加入一個無菌電極杯，電穿孔脈沖為2440 V，5 ms。將電穿孔后細胞懸液接種于1ml BHI液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)16 h后，將菌液接種于抗性BHI培養(yǎng)基(含5μg/ml紅霉素)，37℃厭氧培養(yǎng)7天后收集陽性克隆，命名為

14、P.gingivalisW83-PG083906、突變株的檢測(1)PCR檢測分別使用P.gingivalis16S rRNA引物、erm基因引物和PG0839基因引物對P.gingivalis W83-PG0839 DNA進行PCR檢測。
　　 (2)反轉(zhuǎn)錄PCR檢測根據(jù)PG0839基因編碼序列設(shè)計引物，預(yù)期產(chǎn)物片段為742 bp，對P.gingivalis W83-PG0839 RNA進行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測。
　　 7

15、、P.gingivalis W83-PG0839生物學特性觀察培養(yǎng)P.gingivalis W83和W83-PG0839菌株。觀察兩菌株菌落形態(tài)特征和革蘭染色鏡下特征。觀測、繪制兩菌株的生長曲線。制備1%綿羊紅細胞，取OD600為1.5的P.gingivalis W83和W83-PG0839細菌細胞，進行綿羊紅細胞凝集活性檢測。
　　 8、PG0839在小鼠模型中的毒力作用將昆明小鼠隨機分為7組，每組8只。組1-3為P.ging

16、ivalis W83組(接種菌液濃度分別為2×1010、1×1010、5×109 CFU/ml)，組4-6為P.gingivalis W83-PG0839組(接種菌液濃度分別為2×1010、1×1010、5×109 CFU/ml)，組7為對照組(接種無菌PBS)。在組1-6中每只小鼠背部皮下兩個位點皮下注射0.1 ml的細菌懸液。每日觀測兩次，記錄小鼠的健康狀態(tài)和病損大小，2周后處死所有小鼠。
　　 采用皮爾森(Pearson)

17、卡方檢驗對不同牙周狀態(tài)下基因的檢出率和不同組別小鼠生存率進行比較。采用對數(shù)秩檢驗對不同組別小鼠生存情況進行分析。
　　 9、PG0839基因?qū)谇簧掀ぜ毎a(chǎn)生炎癥因子的影響培養(yǎng)P.gingivalis W83和W83-PG0839菌株，將菌懸液濃度調(diào)至1×108CFU/ml。使用含10%小牛血清的低糖Dulbecco's改良細胞培養(yǎng)基(Dulbecco'smodified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)KB細胞。使用P

18、.gingivalis感染KB細胞，命名為實驗組1；使用W83-PG0839菌株感染KB細胞，命名為實驗組2；對照組為未受細菌感染的KB細胞。將P.gingivalis與KB細胞共同孵育24 h，分別在0.5h、2h、6h、12 h和24 h時，置入Trizol保存。
　　 提取細胞RNA。應(yīng)用白細胞介素-1β(interleukin-1，IL-1β)、IL-6、Toll樣受體-4(Toll like recepector-4，

19、TLR-4)特異性引物對各組RNA進行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測，使用β-actin引物作為內(nèi)參。采用單因素方差分析和T檢驗方法對不同組別的PCR產(chǎn)物灰度值進行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1、慢性牙周炎患者P.gingivalis檢測結(jié)果在慢性牙周炎患者的齦下菌斑標本中，P.gingivalis檢出率為74.44%。
　　 2、PG0836、PG0838和PG0839基因的檢測結(jié)果在P.gingivalis陽性的齦下菌斑中

20、，PG0836、PG0838和PG0839基因檢出率分別為66.17%、24.88%和27.86%。
　　 3、PG0836、PG0838和PG0839基因檢出與臨床牙周指數(shù)的關(guān)系在不同牙周臨床指數(shù)水平，PG0836和PG0838基因檢出率無顯著差異(P>0.05)。
　　 BOP陽性位點的PG0839基因檢出率(28.35%)顯著高于BOP陰性位點(14.29%，x2=5.91，P<0.05)；隨著牙周袋深度增加，PG

21、0839基因的檢出率呈現(xiàn)增高趨勢(P<0.05)。
　　 4、P.gingivalis W83-PG0839突變菌株的構(gòu)建和檢測使用1584 bp PG0839基因產(chǎn)物和pUC19載體構(gòu)建質(zhì)粒pPG0839-1。將2101bperm基因產(chǎn)物插入到pPG0839-1中PG0839基因的EcoR V位點，構(gòu)建質(zhì)粒pPG0839-2，作為電穿孔的供體質(zhì)粒。電穿孔后，使用紅霉素抗性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，命名為P.gingivalis W8

22、3-PG0839。使用P.gingivalis16S rRNA特異性引物進行PCR擴增，結(jié)果顯示P.gingivalis W83-PG0839菌株為牙齦卟啉單胞菌。使用erm基因引物PCR進行擴增，結(jié)果顯示P.gingivalis W83-PG0839菌株基因組DNA中存在erm基因片段。使用PG0839基因引物進行PCR擴增，結(jié)果顯示該菌株基因組DNA中存在插入了2101bp的erm基因的PG0839基因片段。使用PG0839基因引物

23、進行反轉(zhuǎn)錄PCR擴增，結(jié)果顯示該菌株P(guān)G0839基因未轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的RNA。
　　 5、菌株生物學特性觀察(1)菌落形態(tài)觀察P.gingivalis W83-PG0839菌株形成白色、光滑的圓形菌落。兩菌株革蘭染色后鏡下形態(tài)相同，均為桿狀。
　　 (2)菌株生長情況觀察 P.gingivalis W83-PG0839菌株的生長速度低于P。gingivalis W83，但是兩組數(shù)據(jù)缺乏顯著性差異(U=25.50，P=0.19

24、)。
　　 (3)綿羊紅細胞凝集活性研究結(jié)果P.gingivalis W83-PG0839菌株的紅細胞凝集活性顯著降低。
　　 6、PG0839基因?qū)π∈竽Ｐ偷亩玖ρ芯拷臃N5×109 CFU/ml P.gingivalis W83細菌的小鼠生存時間短于接種W83-PG0839細菌的小鼠，但是兩組數(shù)據(jù)無顯著性差異(x2=1.87，P=0.17)。在1×1010 CFU/ml和2×1010 CFU/ml細菌接種水平，兩組生存

25、時間存在顯著性差異(P<0.05)。
　　 在5×109 CFU/ml細菌接種水平，接種P.gingivalis W83細菌的小鼠生存率隨時間延長逐漸降低，生存率低于接種W83-PG0839細菌的小鼠(P>0.05)。在1×1010和2×1010 CFU/ml這兩個細菌接種水平，隨著時間的延長，兩組小鼠生存率逐漸下降，接種P.gingivalis W83細菌的小鼠生存率顯著低于接種P.gingivalisW83-PG0839細菌

26、的小鼠(P<0.05)。
　　 7、PG0839基因?qū)谇簧掀ぜ毎a(chǎn)生炎癥因子的影響當細菌和細胞共同孵育0.5 h到6h，實驗組1的IL-1β和TLR-4 mRNA表達水平呈現(xiàn)時間依賴性增長，在6h時IL-1β和TLR-4 mRNA表達水平達到最高值。隨后，兩炎癥因子mRNA表達水平逐漸下降。在實驗組2中，IL-1β和TLR-4 mRNA表達水平未呈現(xiàn)時間依賴性變化。在24 h內(nèi)，兩實驗組的IL-6 mRNA表達水平與對照組相近

27、。
　　 結(jié)論：
　　 1、在P.gingivalis檢測陽性的齦下菌斑標本中，毒力島基因PG0836和PG0838的檢出與牙周袋深度、臨床附著喪失和探診出血無關(guān)，提示PG0836和PG0838基因可能與P.gingivalis的致病性無關(guān)。
　　 2、在P.gingivalis檢測陽性的齦下菌斑標本中，毒力島基因PG0839檢出與牙周袋深度和探診出血指數(shù)之間存在統(tǒng)計學意義，提示該基因可能在P.gingivali

28、s致病過程中發(fā)揮一定的作用，為牙周病致病性基因。
　　 3、運用等位基因同源重組技術(shù)構(gòu)建P.gingivalis PG0839基因突變菌株，命名為P.gingivalis W83-PG0839。通過PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)對P.gingivalisW83-PG0839菌株進行檢測驗證，證實PG0839基因突變菌株構(gòu)建成功。
　　 4、與P.gingivalis W83比較，P.gingivalis W83-PG0839菌

29、株產(chǎn)生黑色素和紅細胞凝集活性顯著降低。兩菌株生長曲線和鏡下形態(tài)之間未見顯著性差異。結(jié)果表明PG0839基因的缺失改變了細菌的一些生物學特征，提示PG0839基因可能調(diào)控牙齦卟啉單胞菌某些基因或者基因產(chǎn)物的表達。
　　 5、小鼠皮下感染模型表明P.gingivalis W83-PG0839菌株毒性顯著低于W83菌株，結(jié)果提示PG0839基因在P.gingivalis致病過程中發(fā)揮一定的作用。
　　 6、P.gingival