牙齦卟啉單胞菌唾液酸酶基因功能研究.pdf

1、目的：
　　 唾液酸是一種九碳糖酸,在真核細胞和原核細胞中唾液酸用于修飾細胞分子,通常位于糖結(jié)合物如糖蛋白,糖脂的末端,這些糖結(jié)合物在真核細胞表面,血清及唾液中普遍存在。有實驗表明唾液酸與細菌的營養(yǎng),細菌細胞結(jié)構(gòu)的形成及細菌與細胞的相互作用有關(guān)。細菌利用的唾液酸的來源有兩種:內(nèi)源性合成和外源性分解。有些細菌本身有合成唾液酸的能力,通過自身代謝合成唾液酸,即內(nèi)源性合成;而另一些細菌是通過唾液酸酶水解糖結(jié)合物最末端的殘基從而獲得唾液

2、酸,即外源性分解。因此細菌編碼的唾液酸酶及其在不同細菌中的功能倍受學者們的關(guān)注。
　　 唾液酸酶是一種水解酶,可以選擇性的水解糖結(jié)合物末端的殘基,從而獲得游離的唾液酸,唾液酸酶分兩類:內(nèi)切酶和外切酶,外切酶能夠切割α-(2→8)鍵的唾液酸殘基,外切酶能夠切割α-(2→3),α-(2→6),α-(2→8)鍵的唾液酸殘基。實驗表明細菌的唾液酸酶可能與細菌的生長和毒性有關(guān)。Thompson等發(fā)現(xiàn)福賽氏坦納菌唾液酸酶基因(NanH基因)

3、參與唾液酸的代謝;Honma等發(fā)現(xiàn)福賽氏坦納菌的NanH基因同樣參與了福賽氏坦納菌與上皮細胞的相互作用。此外,Banerjee等研究表明肺炎鏈球菌唾液酸酶與細菌的內(nèi)化有關(guān)。Tong等研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌唾液酸酶(NanA)突變株喪失了粘附的能力。由此可見,唾液酸酶在細菌的生存和致病過程中所起的作用不容忽視。
　　 牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是主要的牙周致病菌之一,包

4、含很多毒力因子,如菌毛,蛋白酶等,這些毒力因子在P.gingivalis的粘附和致病過程中發(fā)揮了重要的作用。通過P.gingivalisW83全基因組序列我們發(fā)現(xiàn)PG0352是唾液酸酶的同源基因,推測PG0352在P.gingivalis中編碼唾液酸酶基因,本實驗的目的是通過構(gòu)建PG0352突變株研究唾液酸酶基因在P.gingivalis生長和致病過程中所起的作用。
　　 材料和方法：
　　 一、實驗材料
　　

5、1、主要試劑、儀器:
　　 TSB培養(yǎng)基(Fisher,美國)
　　 質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen,美國)
　　 DNA凝膠回收試劑盒(Qiagen,美國)
　　 引物(Integrated DNA technologies,美國)
　　 PCR擴增儀(Bio-RAD,美國)
　　 電泳儀(Bio-RAD,美國)
　　 自動凝膠成像分析儀(GDS8000,UVP公司,美國)

6、　　 厭氧培養(yǎng)箱(anarobic system,美國)
　　 電穿孔儀(ECM630,BTX公司,美國)
　　 5'RACE試劑盒(Ambion,美國)
　　 紫外分光光度計(Bio-Rad,美國)
　　 96孔板(Falcon,美國)
　　 酶標儀(Bio-Rad,美國)
　　 DIG標記及雜交試劑盒(Roche,美國)
　　 2、實驗菌株,質(zhì)粒及載體:
　　 P.g

7、ingivalis W83
　　 P.gingivalis ATCC33277
　　 P.gingivalis FDC381
　　 齒垢密螺旋體(T.denticota)ATCC33520
　　 E.coli DH5α(NEB,美國)
　　 pGMT easy載體(promage,美國)
　　 質(zhì)粒pVA2198(由紐約州立大學布法羅分?？谇簧飳嶒炇褹shu Shama教授饋贈)

8、　　 質(zhì)粒pPRS415(由紐約州立大學布法羅分?？谇簧飳嶒炇褽laine M.Haase教授饋贈)
　　 二、實驗方法
　　 1、PG0352編碼蛋白的同源性分析
　　 通過PUBMED找出功能明確的唾液酸酶基因,通過Clustal W將PG0352編碼的氨基酸與功能明確的唾液酸酶基因編碼的氨基酸做同源比對。
　　 2、5'RACE和β-半乳糖苷酶活性檢測
　　 提取細菌RNA,采用CIP酶

9、處理后,TAP去掉5'端的2個磷酸基團,在5'端加上adapter,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過巢氏PCR尋找PG0352的轉(zhuǎn)錄起始位點。將PG0352啟動子區(qū)插入到pRS415中,通過檢測β-半乳糖苷酶活性鑒定PG0352啟動子區(qū)的作用。
　　 3、構(gòu)建PG0352突變株
　　 (1)細菌培養(yǎng):P.gingivalis W83菌株接種于新鮮配制的含5％無菌脫纖維羊血,氯化血紅素(5μg/ml)和維生素K(0.5μg/

10、ml)的TSB培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)5-7天。E.coli DH5α菌株接種于Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基,37℃需氧培養(yǎng)。
　　 (2)質(zhì)粒的構(gòu)建:設(shè)計引物擴增PG0352上游及下游基因,順式連接到pGMT-easy載體中,PG0352上游及下游基因之間插入BglⅡ酶切位點,然后從pVA2198中擴增紅霉素基因,將其插入PG0352上游基因和下游基因之間。
　　 (3)質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化及突變株篩選:將100

11、μl P.gingivalis細胞懸液和1μg構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA加入無菌電極杯中,電穿孔脈沖為2500 V,5 ms。將電穿孔后細胞懸液接種于1 ml BHI液體培養(yǎng)基,37℃厭氧培養(yǎng)16 h后,菌液接種于抗性TSB培養(yǎng)基(含5μg/ml紅霉素),37℃厭氧培養(yǎng)7天后收集陽性克隆,命名為PG0352突變株。
　　 4、PG0352蛋白抗體的制作
　　 設(shè)計引物擴增PG03525'端基因,連接至pQE30表達載體中,運用I

12、PTG誘導(dǎo)融合蛋白表達,應(yīng)用Ni-NTA純化蛋白,免疫小鼠,收集血清。
　　 5、Southern blot
　　 采用PG0352基因全長作探針,ClaⅠ租HindⅢ分別酶切細菌全基因組DNA,轉(zhuǎn)到尼龍膜上,經(jīng)過固定,預(yù)雜交,雜交,封閉,洗膜,發(fā)光等過程觀察雜交結(jié)果。
　　 6、Western blot
　　 超聲法制備菌體蛋白,通過12％SDS膠分離,濕轉(zhuǎn)至PVGF膜上,經(jīng)過封閉,一抗,二抗及與ECL

13、底物反應(yīng),最后曝光顯影。
　　 7、唾液酸酶活性檢測
　　 將用PBS洗過的菌細胞滴到含有MUN的濾紙上,37℃,孵育15min,ChemiDocXRS成像系統(tǒng)紫外成像。
　　 8、生長曲線的描繪
　　 將菌液稀釋至OD600=0.005-0.01,繼續(xù)培養(yǎng),定時檢測分光光度(波長600),excel繪制生長曲線。
　　 9、生物膜的形成
　　 用1/2TSB在96孔板中厭氧培養(yǎng)細菌3-4

14、天,加入結(jié)晶紫染液染色,用PBS洗3-4次,95％酒精溶解,酶標儀測OD570。
　　 10、莢膜染色
　　 將培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的細菌涂片用復(fù)紅染色,滴入印第安墨水負染,相差顯微鏡觀察。
　　 11、冰凍掃描體層攝影
　　 將培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的細菌,直接置入液氮中,取出4ml液體在輝光啟電源的銅載網(wǎng)上進行菌落計數(shù),選擇合適的細菌濃度封閉,固定在玻璃質(zhì)中,用電子衍射的方法成像。
　　 12、抗血

15、清試驗
　　 收集健康人血清,將P.gingivalis培養(yǎng)基中加25％血清,分別在1小時和3小時涂板,計算生存率。
　　 13、動物試驗檢測細菌毒力
　　 取10×1010 CFU/ml菌細胞0.1ml,接種于小鼠背部中線偏0.1cm處皮下,每天觀察老鼠的狀態(tài),體重,皮毛的情況,注射部位有無紅腫潰爛,其它部位有無異常等。
　　 結(jié)果：
　　 1、PG0352編碼蛋白同源性分析結(jié)果
　　

16、PG0352基因全長1580bp,編碼526個氨基酸。PG0352與綠膿假單胞菌及噬二氧化碳細胞菌的唾液酸酶基因的同源性分別為46.6％和42.3％,并含有3個唾液酸酶基因特有的功能基序。
　　 2、PG0352在P.gingivalis標準株中的檢測
　　 P.gingivalis ATCC33277,P.gingivalis FDC381和P.gingivalis W83均有唾液酸酶基因檢出。
　　 3、PG

17、0352啟動子序列檢測結(jié)果
　　 PG0352基因的轉(zhuǎn)錄起始位點位于-102bp處的“A”,下劃線標記的“ATG”為PG0352基因的翻譯起始位點,“AAACGG”為富含嘌呤的區(qū)域,啟動子-10區(qū)推測為“TCLTATT”,-35區(qū)推測為“TTGGGA”。
　　 4、β半乳糖苷酶活性檢測結(jié)果
　　 插入PG0352啟動子序列的pRS415β半乳糖苷酶活性為5190.33±284.02miller,比無啟動子的pRS

18、415β半乳糖苷酶活性高100倍以上,P＜0.01。
　　 5、PCR鑒定PG0352突變株結(jié)果
　　 在PG0352突變株中,通過雙向交換的方式原PG0352基因被紅霉素基因所取代。
　　 6、RT-PCR鑒定PG0352突變株結(jié)果
　　 PG0352突變株中在RNA水平上沒有PG0352檢出。
　　 7、Southern,western及唾液酸酶活性鑒定PG0352突變株結(jié)果
　　 P

19、.gingivalis W83野生株P(guān)G0352基因Southern,westerm及唾液酸酶活性結(jié)果均為陽性,而PG0352突變株均為陰性。
　　 8、P.gingivalis W83野生株和PG0352突變株生長曲線的比較
　　 P.gingivalis W83野生株和PG0352突變株的生長沒有顯著性差異,加入唾液酸酶后兩者間生長同樣沒有顯著性差異。
　　 9、P.gingivalis W83野生株和PG0

20、352突變株生物膜形成的比較
　　 與P.gingivalis W83野生株相比,PG0352突變株生物膜形成能力降低,加入唾液酸后PG0352突變株生物膜形成能力有所提高,并呈濃度依賴性。
　　 10、P.gingivalis W83野生株和PG0352突變株莢膜的比較
　　 P.gingivalis W83有莢膜,厚度大約為20-30nm,較致密,而PG0352突變株形成的莢膜很弱,較松散。
　　 1

21、1、抗血清試驗結(jié)果
　　 P.gingivalis W83野生株在25％健康人血清中的生存率高于PG0352突變株,1小時和3小時P.gingivalis W83野生株的生存率分別為101.14％±3.96％和77.58％±4.07％,而PG0352突變株的生存率分別為22.37％±4.07％和26.24％±2.53％,P.Gingivalis W83野生株與PG0352突變株相比有顯著性差異P＜0.01。
　　 12、

22、細菌毒力檢測的動物實驗結(jié)果
　　 P.gingivalis W83野生株組在6天內(nèi)三只小鼠均死亡。PG0352突變株組中兩只小鼠在第4天注射部位出現(xiàn)膿腫,膿腫大小為44.16 m2和28.26 m2,第8,9天膿腫破潰,另一只在注射部位沒有異常,在第6天腹部出現(xiàn)潰瘍,大小為:2mm×2mm。
　　 .結(jié)論：
　　 1、PG0352基因全長1580bp,編碼526個氨基酸,有三個特殊的基序,編碼唾液酸酶。
　

23、　 2、PG0352轉(zhuǎn)錄起始位點在-102bp處,可能受sigma70調(diào)控。
　　 3、運用等位基因同源重組技術(shù)構(gòu)建P.gingivalis PG0352突變菌株。通過PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR,southern,western,唾液酸酶活性對PG0352突變菌株進行檢測驗證,證實PG0352突變株構(gòu)建成功。
　　 4、與P.gingivalis W83比較,PG0352突變株形成生物膜能力降低,但生長不受影響。