水產(chǎn)品中副溶血性弧菌幾種檢測(cè)方法的研究.pdf

1、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)食源性疾病位居微生物性食源性疾病之首，已經(jīng)成為我國(guó)一個(gè)嚴(yán)重的食源性公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。副溶血性弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)是致病微生物研究的熱點(diǎn)之一，本文利用PCR原理建立了多種快速檢測(cè)方法，并應(yīng)用于青島市部分水產(chǎn)品的檢測(cè)，取得了良好的效果。
　　 本文首先以副溶血性弧菌為對(duì)象，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其增菌培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度、起始pH和培養(yǎng)基鹽分對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)有顯

2、著性影響，其最佳培養(yǎng)條件為：起始pH為7.5，培養(yǎng)溫度為34℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)基鹽分為3.5％，培養(yǎng)時(shí)間為22 h。
　　 在細(xì)菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，本文建立了普通PCR快速檢測(cè)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的方法，菌液靈敏度103CFU/mL，對(duì)于含副溶血性弧菌1～10 CFU/g以上的樣品經(jīng)增菌6 h后即可檢出。該方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，將檢測(cè)周期縮短到10 h，適合水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的快速檢測(cè)。將PCR方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(

3、GB/T4789.7-2003)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示PCR方法的靈敏性高于國(guó)標(biāo)方法。
　　 為了進(jìn)一步區(qū)別致病和非致病性副溶血性弧菌，本文針對(duì)副溶血性弧菌的tlh和tdh兩基因成功地建立了雙重PCR，用分子生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)了副溶血性弧菌兩種不同致病類型的區(qū)分。將雙重PCR應(yīng)用于水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測(cè)，并初步得出了青島市水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染的數(shù)據(jù)，總檢出率為56.98％，致病性副溶血性弧菌的檢出率為1.74％。
　

4、　 隨后，本實(shí)驗(yàn)還建立了SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)副溶血性弧菌的方法。采用四步法，即在變性、退火、延伸三步之后，引入第四步80℃收集熒光信號(hào)，此時(shí)，引物二聚體已經(jīng)完全處于解鏈狀態(tài)，而特異性產(chǎn)物仍然處于雙鏈狀態(tài)，此時(shí)收集的熒光信號(hào)可真實(shí)的反映特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量。該方法檢測(cè)樣品DNA的最低量為103copies，在模板濃度104～108copies/μL時(shí)，其對(duì)數(shù)值與CP值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，定量準(zhǔn)確。
　　 最后

5、，本實(shí)驗(yàn)將PCR-ELISA方法引入了副溶血性弧菌的檢測(cè)，設(shè)計(jì)了針對(duì)tlh、tdh基因兩對(duì)特異性引物和探針，構(gòu)建了tlh基因的克隆載體用于定量分析，建立了PCR-ELISA定量檢測(cè)副溶血性弧菌砌和tdh基因的方法，檢測(cè)DNA最低量為103copies。
　　 通過(guò)上述幾種檢測(cè)方法以及目前應(yīng)用的一些副溶血性弧菌檢測(cè)方法的比較，可以看出：關(guān)于定性方法，國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的成本以及對(duì)儀器要求較低，但檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)且操作繁瑣，不宜對(duì)食品中副溶血

6、性弧菌進(jìn)行即時(shí)的檢測(cè)；利用全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè)成本較高，該儀器設(shè)備昂貴，中小型實(shí)驗(yàn)室難以承受；分子生物學(xué)技術(shù)PCR方法引入副溶血性弧菌的檢測(cè)，使得檢測(cè)周期大大縮短，所需儀器設(shè)備要求適中，且結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高適合各類實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展檢測(cè)任務(wù)。關(guān)于定量方法，利用MPN法(行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN0173-92)對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行定量，檢測(cè)周期4～5d，且定量較為粗放；而利用熒光定量方法或者PCR-ELISA方法進(jìn)行定量結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，且大大