腺病毒介導重組人源化ING4基因抑制非小細胞肺癌NCI-H460細胞生長機制研究.pdf

1、目的：重組構(gòu)建人源化ING4腺病毒表達載體，并探究其對非小細胞肺癌NCI—H460細胞株體內(nèi)外生長抑制作用及其相關(guān)分子機制。 方法：運用定點突變技術(shù)，在已成功克隆mING4（鼠ING4）的基礎(chǔ)上，根據(jù)hING4（人ING4）氨基酸序列，進行重組構(gòu)建。設(shè)計兩對突變引物P1、P2和P3、P4及全長ING4上下游引物P5、P6，通過四輪PCR，將mING4基因序列進行人源化改造，獲得了編碼hING4氨基酸的基因序列（簡稱ING4）。將

2、獲得酶切目的基因片段，連接到轉(zhuǎn)移載體pAdTrack—CMV上，形成重組轉(zhuǎn)移載體pAdTrack—CMV—ING4。重組轉(zhuǎn)移載體經(jīng)PmeⅠ酶切后與pAdEasy—1腺病毒載體在BJ5183大腸桿菌中同源重組，得到重組腺病毒載體pAdeasy—1—pAdTrack—CMV—ING4，經(jīng)PacⅠ酶切后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI—293A包裝細胞，獲得重組腺病毒Ad—ING4。通過類似的方法獲得了重組空載體病毒Ad—null。將獲得同源重組Ad—ING

3、4病毒感染非小細胞肺癌NCI—H460細胞（p53野生型），運用RT—PCR及熒光顯微鏡檢測ING4基因在H460細胞中表達及對H460細胞毒作用（CPE）；運用MTT法、細胞集落形成試驗及流式細胞儀檢測Ad—ING4對腫瘤細胞生長抑制及誘導凋亡作用；運用激光共聚焦顯微鏡及透射掃描電鏡檢測H460細胞經(jīng)ING4基因作用后形態(tài)學改變；運用RT—PCR、Western—blotting檢測分析Ad—ING4誘導腫瘤細胞凋亡可能分子機制；運用

4、RT—PCR和ELISA方法檢測ING4基因?qū)δ[瘤主要血管生成相關(guān)基因VEGF的作用；在nu/nu裸鼠皮下建立NCI—H460肺癌荷瘤鼠模型，觀察Ad—ING4基因?qū)δ[瘤生長抑制作用及對血管生成影響。 結(jié)果：基因序列檢測和RT—PCR結(jié)果證實獲得重組人源化ING4基因，并成功構(gòu)建重組人源化ING4腺病毒表達載體。RT—PCR和熒光顯微鏡檢測證實ING4基因可以在H460細胞中穩(wěn)定表達并對H460細胞產(chǎn)生細胞毒作用（CPE）；MT

5、T檢測和細胞集落形成試驗結(jié)果表明較對照組（Ad—null組，PBS組）相比，ING4基因可以明顯抑制基因治療組腫瘤細胞生長；流式細胞儀檢測證實Ad—ING4可誘導腫瘤細胞凋亡；激光共聚焦顯微鏡和透射掃描電鏡檢測顯示H460細胞經(jīng)ING4基因作用后可發(fā)生細胞凋亡形態(tài)學改變，并出現(xiàn)凋亡小體；RT—PCR、Western—blotting檢測結(jié)果提示Ad—NG4基因以p53依賴方式誘導腫瘤細胞上調(diào)p21和Bax基因表達，下調(diào)Bcl—2和Sur

6、vivin基因表達來誘導腫瘤細胞凋亡；RT—PCR和ELISA檢測提示ING4基因可以抑制腫瘤主要血管生成相關(guān)基因VEGF表達；體內(nèi)試驗表明Ad—ING4基因可以抑制腫瘤生長并抑制腫瘤體內(nèi)血管生成。 結(jié)論：運用定點突變技術(shù)對mING4進行了人源化改造，并成功重組構(gòu)建了人源化ING4腺病毒表達載體；經(jīng)RT—PCR和熒光顯微鏡檢測證實腺病毒Ad—ING4可以在非小細胞肺癌NCI—H460細胞株中穩(wěn)定表達；腺病毒Ad—ING4在非小細

7、胞肺癌NCI—H460細胞株中表達可致肺癌細胞產(chǎn)生細胞病變（CPE），并主要通過誘導細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤細胞增殖；腺病毒Ad—ING4誘導非小細胞肺癌NCI—H460細胞凋亡的主要分子機制是以p53依賴方式上調(diào)促凋亡因子Bax表達，下調(diào)Bcl—2、Survivin表達，誘導腫瘤細胞凋亡；腺病毒Ad—ING4同時通過促進p53反應(yīng)基因p21表達，上調(diào)Bax表達，并改變Bax/Bcl—2比例，促進腫瘤細胞凋亡；腺病毒Ad—I