幾丁酶-蛋白酶融合基因的構建與球孢白僵菌毒力的提高.pdf

1、昆蟲病原真菌是一類重要的生防真菌，在農(nóng)林害蟲的防治上起著重要的作用。它主要通過機械壓力和水解酶的作用來穿透昆蟲體壁，Pr1類蛋白酶和幾丁質酶在其中起著重要作用。前人的研究表明，超量表達蛋白酶或幾丁酶基因可以提高重組菌株的毒力，但目前對于二者在穿透昆蟲體壁時是否存在協(xié)同作用還不清楚。 為了研究蛋白酶和幾丁酶在昆蟲病原真菌穿透寄主體壁時的相互作用，本文首先用掃描電鏡觀察了被蛋白酶CDEP-1、幾丁酶Bbchit1及二者混合酶液處理過

2、的桃蚜體壁，結果表明，蛋白酶與幾丁酶混合液分解寄主體壁的能力更強。 進而將球孢白僵菌Pr1類蛋白酶基因CDEP-1分別與幾丁酶基因Bbchit1和Machit1融合，分生孢子電擊轉化法將融合基因導入球孢白僵菌中。Northernblotting和Westernblotting結果證明，這些基因均在重組菌株中組成性轉錄和表達。 生物測定結果表明，超量表達CDEP-1、Bbchit1單價基因及二者融合基因CDEP-1∷Bbc

3、hit1均能提高重組菌株對桃蚜的毒力，且融合基因重組菌株的毒力提高幅度更大。在孢子濃度為1×107個/ml時，與野生型菌株Bb0062-15相比，超量表達蛋白酶CDEP-1基因重組菌株的致死中時(LT50)平均縮短了8.84﹪；超量表達幾丁酶Bbchit1基因重組菌株的LT50平均縮短了9.92﹪；而融合基因CDEP-1∷Bbchit1重組菌株的LT50平均縮短了21.12﹪。接種108h及120h后，融合基因CDEP-1∷Bbchit

4、1重組菌株CDEP-1∷Bbchit1-41的致死中濃度(LC50)分別降低了67.42﹪和60.50﹪，下降幅度分別為CDEP-1-6和Bbchit1-26LC50之和的2.22(108h)和1.65倍(120h)。表明超量表達融合基因CDEP-1∷Bbchit1能協(xié)同提高球孢白僵菌對寄主的毒力。 生物測定結果還表明，單獨超量表達綠僵菌幾丁酶Machit1基因不能提高重組菌株的毒力，但超量表達融合基因CDEP-1∷Machit

5、1的重組菌株卻能顯著提高球孢白僵菌的毒力。在孢子濃度為1×107個/mL時，超量表達融合基因CDEP-1∷Machit1重組菌株的LT50平均縮短了18.07﹪；在108h及120h時，CDEP-1∷Machit1-37的LC50分別比野生型菌株縮短了38.89﹪(108h)和41.68﹪(120h)，均低于相應濃度及時間下蛋白酶基因CDEP-1重組菌株的LT50及LC50。 上述結果表明，昆蟲病原真菌的蛋白酶和幾丁質酶在分解昆